葛根及其复方配伍对自身免疫性重症肌无力大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表达的影响

陈 茉，文颖娟，杨俊超，彭高强，王河江，仝武宁

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属渭南市中心医院，陕西 渭南 714000）

重症肌无力（myasthenia gravis，MG） 是一种受自身抗体介导的获得性神经-肌肉接头免疫性疾病［1］。以眼睑下垂、骨骼肌无力、易疲劳为主要临床表现，多采用糖皮质激素、胆碱酯酶抑制剂、免疫球蛋白等药物治疗［2］，虽在一定程度上可缓解患者临床症状，但长期用药易发生肝肾功能损害、内分泌系统失衡等一系列不良反应，严重危及患者生命。故选取有效靶点，深层次探析MG 发病与治疗机制，已迫在眉睫。

经研究证实，线粒体与MG 骨骼肌异常密切相关［3］。一方面，当骨骼肌线粒体发生异常，机体自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载等，使得异常线粒体过度堆积于体内，出现胞睑下垂、运动障碍等症状；另一方面，若肌肉组织中正常线粒体数目过少，则无法产生足够的能量以维持肌肉的收缩活动，亦会出现四肢无力等临床表现［4］。因此，本研究以骨骼肌线粒体为出发点，研究归脾胃经药物葛根及其复方对骨骼肌线粒体内膜蛋白Mitofilin、视神经萎缩蛋白（optic atrophy 1，OPA1） 的影响，深入探讨自身免疫性重症肌无力 （experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG） 发病与治疗机制，以期为从“脾-肌肉-线粒体” 角度治疗重症肌无力提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雌性大鼠80 只，体质量160～180 g，购于四川成都达硕实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （川） 2020-030］。

1.2 药物 葛根组由葛根20 g 组成；葛芪组由葛根20 g、黄芪15 g 组成；葛参组由葛根20 g、丹参15 g 组成；葛妙组由葛根20 g、苍术15 g、黄柏15 g、牛膝15 g、薏苡仁15 g 组成；葛根复方组由葛根20 g、黄芪15 g、丹参15 g、苍术15 g、牛膝15 g、黄柏15 g、薏苡仁15 g 组成。中药饮片均购于陕西中医药大学校医院，按常规煎法分别浓缩成50 mL 药液，大鼠用药量为成人用药的6.25 倍。强的松组采用强的松混悬液，由0.2%羧甲基纤维素钠配制。

1.3 试剂 鼠源性R97～R116 肽段、完全弗氏试剂（complete freund’ s adjuvant，CFA）、不完全弗氏试剂（incomplete freund’ s adjuvant，IFA）、PBS 磷酸缓冲液、2.5% 戊二醛 （货号C8385FE270-1、F5881、F5506、ZLI-9062、P1126，陕西博达生物科技有限公司）；ECL 超敏发光试剂盒、Mitofilin 兔抗大鼠多克隆抗体、OPA1 兔抗大鼠多克隆抗体、乙酰胆碱受体抗体 （acetylcholine receptor antibody，AchR-ab） ELISA 试剂盒、电泳液、转膜液、一抗稀释液、二抗稀释液、封闭液 （货号WB0164、BS-1824R、PB0773、ml003131、WB0132、WB0154、WB0158、WB0159、WB0161，西安阿尔宝生物科技有限公司）。

1.4 仪器 超净工作台、165-8001 型垂直电泳槽、170-3930 型Trans-Blot 转印槽（美国Bio-Rad 公司）；Multiskan FC550 型酶标仪 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）；JY88-Ⅱ型超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、SH01D 型高速台式离心机（上海知信实验仪器技术有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立 将80 只大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、葛根组、葛芪组、葛参组、葛妙组、葛根复方组、强的松组，每组10 只，除空白组外，其余7 组均参考文献［5］ 报道方法复制EAMG 模型。将鼠源性R97～R116 肽段、CFA、PBS 按照1 ∶1.5 ∶1.5 比例充分混匀制成免疫乳剂，取乳剂200 μL 于大鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射；首次免疫后30、45 d，将三者再次按照1 ∶3 ∶3比例充分混匀制成免疫乳剂后，取乳剂200 μL 强化接种。空白组则在同一时间段注射等量PBS。观察大鼠进食量、饮水量、毛色以及体质量（每周称量3 次） 变化。

2.2 分组及给药 最后1 次造模2 d 后进行灌胃给药，各组给药剂量分别为葛根组2.08 g／kg、葛芪组3.65 g／kg、葛参组3.65 g／kg、葛妙组8.33 g／kg、葛根复方组11.46 g／kg，强的松组5.4 mg／kg；空白组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每天1 次，连续给药4 周。

2.3 血清IFN-γ、IL-4 水平检测 分别于造模后2 周和给药结束24 h 后，大鼠体外静脉取血，检测血清中干扰素γ（interferon γ，IFN-γ） 和白细胞介素4 （interleukin 4，IL-4） 水平。

2.4 大鼠腓肠肌肌电平均振幅变化 仰卧位固定大鼠，通过针电极将地线固定于大鼠尾部，沿肌纤维走行于记录电极旁开3～5 mm 处缓慢插入另一单极针作为参考电极，给予0.5～1 Hz 电流刺激强度，分别于造模后2 周和灌胃给药结束24 h 后，采用MPA2000 软件进行肌电振幅变化分析。

2.5 血清AchR-ab 水平检测 给药结束24 h 后麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 r／min 离心15 min，分离得血清，于-20 ℃保存，严格按照AchR-ab ELISA 试剂盒说明书检测血清AchR-ab 水平。

2.6 骨骼肌线粒体超微结构观察 处死大鼠后迅速分离坐骨神经，取胫骨前肌分支，利用锋利刀片修成2 mm×2 mm×2 mm 大小块，浸泡于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中4 ℃固定2 h，再浸于1%四氧化锇液中固定1 h，脱水包埋后，切成约50 nm 厚度，以铅、铀染色，于透射电镜下观察。

2.7 Western blot 法检测Mitofilin、OPA1 蛋白表达 处死大鼠后迅速分离大鼠胫骨前肌，剪切成细小碎片，匀浆、裂解，离心后取上清液，检测蛋白浓度。经制胶、上样、电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入稀释后的一抗 （1 ∶1 000） 4 ℃孵育过夜，洗涤条带，加入二抗（1 ∶500） 室温孵育显影，采用Image-Pro Plus 软件分析灰度值，以βactin 条带灰度值为参照，计算目的蛋白Mitofilin、OPA1 相对表达。

2.8 统计学分析 通过SPSS 25.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，符合正态分布数据采用t检验和方差分析；非正态分布数据则采用秩和检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠体质量的影响 如表1 所示，首次免疫前各组体质量均无显著差异 （P＞0.05）。免疫后第4 周（给药前），模型组和各给药组大鼠体质量低于空白组（P＜0.01）；免疫后第6 周（给药第2周），模型组和各给药组大鼠体质量低于空白组 （P＜0.01），且各给药组大鼠体质量与模型组比较无显著差异（P＞0.05）；免疫后第8 周（给药第4 周），模型组大鼠体质量低于空白组（P＜0.01），各给药组大鼠体质量高于模型组（P＜0.01）。

表1 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠体质量的影响（g，±s，n＝10）

表1 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠体质量的影响（g，±s，n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

组别首次免疫前第4 周第6 周第8 周空白组201.9±9.33217.2±10.59234.8±10.08247.8±11.13模型组203.4±10.62192.4±10.25△△185.4±8.54△△177.4±6.31△△强的松组199.0±6.11189.7±7.62△△182.9±5.28△△201.9±8.20**葛根组204.5±12.96192.4±11.87△△186.7±8.96△△197.4±7.57**葛芪组196.7±11.47187.1±10.73△△181.9±7.68△△196.5±6.80**葛参组197.0±6.46185.3±10.64△△180.5±9.90△△195.1±9.94**葛妙组202.5±7.17185.7±9.64△△180.3±9.41△△196.5±10.84**葛根复方组200.4±7.40189.4±7.75△△181.7±5.03△△204.3±13.14**

3.2 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平的影响 如表2 所示，给药前，与空白组比较，模型组和各给药组大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平均升高（P＜0.01）；给药后，与模型组比较，各给药组大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平均降低（P＜0.01）。

表2 EAMG 大鼠各组IFN-γ、IL-4 变化测定（pg／mL，±s，n＝10）

表2 EAMG 大鼠各组IFN-γ、IL-4 变化测定（pg／mL，±s，n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05。

组别IL-4给药前给药后给药前给药后IFN-γ空白组0.136±0.0120.134±0.01512.21±1.4113.42±0.93模型组0.184±0.009△△0.180±0.010△△32.24±2.31△△30.63±1.22△△强的松组0.192±0.013△△0.153±0.017**34.41±2.01△△18.85±2.02**葛根组0.195±0.013△△0.162±0.010**●33.37±1.09△△22.67±3.24**葛芪组0.189±0.013△△0.170±0.010**●34.13±1.09△△24.34±2.52**葛参组0.192±0.013△△0.165±0.010**●33.68±1.09△△22.10±3.09**葛妙组0.191±0.013△△0.166±0.010**●35.45±1.09△△25.26±2.34**葛根复方组0.194±0.008△△0.144±0.011**35.18±2.09△△15.54±3.12**●

3.3 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠腓肠肌肌电平均振幅的影响 如表3 所示，给药前，与空白组比较，EAMG 大鼠腓肠肌肌电平均振幅降低（P＜0.01）；给药4 周后，与模型组比较，各给药组大鼠腓肠肌肌电平均振幅升高（P＜0.01），其中以强的松组和葛根复方组升高最为显著。

表3 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠腓肠肌肌电平均振幅的影响（μV，±s，n＝10）

表3 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠腓肠肌肌电平均振幅的影响（μV，±s，n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05。

组别给药前给药后空白组19.7±1.319.3±1.0模型组6.2±0.9△△6.5±0.4△△强的松组4.7±0.8△△16.9±0.3**葛根组5.4±0.3△△14.1±0.5**葛芪组5.9±0.2△△13.5±0.7**葛参组6.2±0.5△△14.9±0.4**葛妙组6.0±0.3△△13.1±0.6**葛根复方组5.5±0.5△△17.7±0.7**●

3.4 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠血清AchR-ab 水平的影响 如表4 所示，与空白组比较，模型组大鼠血清AchRab 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清AchR-ab 水平降低（P＜0.01），其中以葛妙组、强的松组、葛根复方组最为显著。

表4 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠血清AchR-ab 水平的影响（±s，n＝10）

表4 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠血清AchR-ab 水平的影响（±s，n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05。

组别AchR-ab空白组0.074±0.010模型组0.339±0.019△△强的松组0.218±0.021**葛根组0.245±0.014**●葛芪组0.240±0.023**葛参组0.240±0.014**●葛妙组0.216±0.022**葛根复方组0.212±0.022**

3.5 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠骨骼肌线粒体超微结构的影响 如图1 所示，正常情况下，骨骼肌线粒体呈线状或杆状，均匀分布于Z 线两侧，双层核膜清晰完整，内嵴膜结构清晰，排列规则，基质分布均匀，线粒体无肿胀或空泡变性形态。与空白组比较，模型组可见线粒体肿胀明显，甚至出现线粒体空泡变性，内嵴排列紊乱、断裂，部分可见内嵴溶解消失；与模型组比较，各给药组线粒体肿胀程度减弱，线粒体数目增多，内嵴排列较为整齐，未见明显空泡化。

图1 各组大鼠线粒体超微结构示意图（×30 000）

3.6 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠骨骼肌线粒体塑性蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠骨骼肌线粒体Mitofiln、OPA1 蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表达升高（P＜0.05），其中以葛根复方组和强的松组的变化情况最为显著，见图2、表5。

图2 各组大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白电泳图

表5 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表达的影响（±s，n＝5）

表5 葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表达的影响（±s，n＝5）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与强的松组比较，●P＜0.05。

组别Mitofilin／β-actinOPA1／β-actin空白组3.26±0.042.66±0.19模型组0.07±0.01△△0.26±0.04△△强的松组1.67±0.17**1.72±0.11**葛根组0.34±0.04**●0.46±0.06**●葛芪组0.34±0.02**●0.80±0.04**●葛参组0.43±0.01**●0.86±0.02**●葛妙组1.56±0.01**1.55±0.03**葛根复方组2.33±0.19**●1.85±0.06**

4 讨论

重症肌无力属中医“痿证” 范畴。《素问·痿论》言：“脾主肌肉”，《脾胃论》 中亦提到：“脾胃俱旺，则能食而肥；脾胃俱虚，则不能食而瘦……脾虚则肌肉削”。强调脾胃作为气血生化之源，滋养全身。全身健壮的体现首先来自气血充盛，其次来自肌肉强健。肌肉为气血所养，气血为脾胃所化，脾胃强盛则肌肉强健。葛根为根，根主上升，甘味入脾，能补脾胃之气，脾胃气盛则肌肉力强，辛则散表，升举阳气，解其肌腠。国家级名老中医裘昌林［6］、周仲瑛［7］、李声岳［8］、刘友章［9］等均以葛根配伍治疗重症肌无力，临床疗效确切。前期实验研究亦证实，葛根及其复方配伍通过调节氮自由基（RNS） 衰减水平以及ATP 酶活性等恢复EAMG 大鼠心肌、平滑肌、胸腺组织线粒体正常功能，有效降低AchR-ab 表达［10-14］。因此，本实验仍以葛根为主药，以期能够明确葛根及其复方配伍对EAMG 大鼠骨骼肌线粒体的调控机制。

线粒体嵴是保障线粒体正常功能的重要结构之一［15］，嵴连接点 （crista junctions，CJs） 可能通过Mitofilin 和OPA1 之间的相互作用［16］参与线粒体氧化磷酸化，完成线粒体塑性，实现线粒体生物合成［17-18］。研究发现，重症肌无力患者体内OPA1 蛋白失活，线粒体管状网络结构裂解，出现线粒体过度分裂［19］，而通过上调神经肌肉病变小鼠线粒体内Mitofilin 蛋白表达，能够有效提升OPA1 蛋白表达，恢复线粒体形态功能［20］。此外，细胞因子IFN-γ 和IL-4 能够通过调节B 细胞，干预AchR-ab 表达［21］。在EAMG 模型中，若IL-4 过度表达，将刺激Th1 细胞大量分泌IFN-γ，导致骨骼肌运动终板发生超敏反应，诱发或加重MG 临床症状［22-23］。通过降低IFN-γ 和IL-4 水平，可有效减弱乙酰胆碱受体抗体浓度，起到积极的治疗作用［24-25］。

本研究证实，葛根及其复方配伍可通过上调线粒体塑性蛋白Mitofilin、OPA1 表达，干预线粒体内嵴形态，有效调节AchR-ab、IFN-γ、IL-4 水平，提高腓肠肌肌力水平，一定程度上恢复EAMG 大鼠骨骼肌线粒体正常功能。而葛根及其复方配伍能否通过影响线粒体塑性蛋白表达，调控EAMG 大鼠线粒体动力学相关蛋白表达，影响线粒体生物合成，仍有待进一步证实。