程序化药物释放纳米涂层的构建及其体外实验研究

杨进　梅劲桦　刘震杰

[摘要] 目的 构建肝素、强的松和紫杉醇程序化药物释放纳米涂层，并考察该纳米涂层的体外释放情况和对血管内皮细胞的影响。 方法 结合异步降解技术和静电纺织技术制备己内酯/碳酸亚乙酯共聚物[Poly（CL-co-EC）]的纳米载体；高压液相色谱法测定载药体系紫杉醇包封率和体外释放曲线；MTT实验和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒分别测定人血管内皮细胞的存活率和LDH释放率。 结果 程序化药物释放体系中肝素、强的松和紫杉醇的包封率分别为97.3%、81.2%和75.7%，载药量分别为10.4%、9.3%和14.1%。三种药物在体外均缓慢释放，60 d时累计释放量分别达到96%、55%和8%。程序化药物释放纳米涂层能显著降低血管内皮细胞的存活率并提高LDH释放率。 结论 程序化药物释放纳米涂层能依次缓慢释放肝素、强的松和紫杉醇，并抑制血管内皮细胞生长，对于降低支架植入术后血管再狭窄有潜在应用价值。

[关键词] 纳米涂层；紫杉醇；强的松；肝素；血管支架；程序化

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）36-0005-04

Establishment of nano-coating for controlled drug release and its in vitro experiment

YANG Jin MEI Jinhua LIU Zhenjie

Department of Vascular Surgery， Sir Run Run Shaw Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310016，China

[Abstract] Objective To establish a nano-coating for controlled heparin/prednisone/taxol release and investigate the release curve of the nano coating and effects on vascular endothelial cells. Methods The technology of asynchronous degradation and electrostatic spinning technique were used to prepare nano-drug carrier. High pressure liquid chromatography（HPLC） was used to determine the embedding ratio and release curve of nano coating. MTT and lactate dehydrogenase（LDH） kits were applied to test cells survival rate and LDH release respectively. Results The embedding ratios of heparin prednisone and paclitaxel in nano-coating were 97.3%，81.2% and 75.7%， and drug-loading rate were 10.4%，9.3% and 14.1%，respectively. These three drugs were slow-release in vitro and the accumulative release quantities were 96%， 55% and 8%. This nano-coating for controlled drug release significantly reduced the survival rate of vascular endothelial cells and improved the LDH release rate. Conclusion The nano coating for controlled drug release established in this study slowly releases heparin， prednisone and taxol step by step， and inhibits the growth of endothelial cells， which supplies a potential way to reduce vascular restenosis after stent implantation.

[Key words] Nano coating； Taxol； Prednisone； Heparin； Stent； Procedural

动脉粥样硬化性冠心病的发生率逐年增加，严重威胁着人类健康[1]。药物洗脱支架作为近年来最为有效的介入治疗的一种，是将支架上负载药物定点释放到狭窄部位，确保药物对病灶疗效最大化，并将对其他器官的毒副作用降到最小[2]。然而，和其他介入治疗一样，药物洗脱支架仍存在术后再狭窄问题[3]，是支架植入术亟待解决的问题。研究表明[4-6]，支架植入后局部组织出现以下几个阶段性的变化：①2周内，血小板聚集，凝血系统激活，同时炎症细胞聚集，新生内皮开始形成；②2～8周内，支架表面逐步被新生内膜完全覆盖，平滑肌细胞增殖；③8～32周，细胞外基质分泌增多，成纤维细胞增殖，病灶逐渐纤维化。本文拟将分别具有抗增殖、抗炎和抗血栓能力的紫杉醇、强的松和肝素集中于一个高分子药物释放系统，并构建程序性释放的纳米涂层，旨在分阶段有目标性地抑制血管再狭窄的发生。

静电纺织是属于纳米技术中的一种，其可以制作比用常规方法小几个数量级的纳米级纤维[7]，易实现药物在局部的长时间停留和靶向释放。我们前期研究得出不同单体比例可制备得到不同降解速率的聚己内酯和碳酸亚乙酯共聚物[Poly（EC-CL）]材料，且该共聚物表现出了良好的生物相容性和理化性能[8]。本研究即采用[Poly（EC-CL）]共聚物结合异步降解技术和静电纺织技术，分别将紫杉醇、强的松和肝素涂布于一个纳米载体，构建出程序性药物释放纳米涂层，并通过体外试验初步评价其对血管内皮细胞的作用，为今后研制抗内膜增殖程序化药物释放血管内支架的研制提供前期基础研究。

1 材料与方法

1.1 程序化药物释放纳米涂层的制备

1.1.1 药物载体的制备 共聚物Poly（CL-co-EC）的制备参照已发表文献[8]，步骤概括如下：①氩气环境下，使用Nd（DBMP）3催化合成不同比例CL/EC含量的共聚物Poly（CL-co-EC）。②样品模压制备成长×宽×高为30 mm×12 mm×2 mm的规整板材。③使用静电纺丝法制备纳米级的纤维、膜材料和支架材料。通过调节电压（0～10 kV）、纺丝液流速（0.1 mL/h～5 mL/h），制备不同纳米直径的纤维。

1.1.2 药物包埋与涂布 紫杉醇的包埋：对CL/EC=9的Poly（CL-co-EC）共聚物混合己二酸酐进行电纺制备孔隙率在90%以上的电纺膜，电纺丝直径在400～800 nm。先期在生理盐水中静置3 d，等酸酐降解后进行扫描电镜观察，并用DMSO溶解紫杉醇，包裹于共聚物颗粒中，颗粒直径在100 nm左右。将先期降解后的Poly（CL-co-EC）电纺膜置于DMSO溶液中24 h，常温。

强的松和肝素的包埋和涂布：表面静电纺CL/EC=6的Poly（CL-co-EC）共聚物电纺丝，以控制紫杉醇的释放。将该薄膜置于一定浓度强的松的溶液中24 h，再进行表面电纺CL/EC=4的Poly（CL-co-EC）共聚物电纺丝，对程序性降解电纺涂层进行表面涂布肝素。

1.2 药物体外释放实验

准确称取程序化释放药物加磷酸盐缓冲溶液（10 mmol/L、pH 7.4）制成均一悬浮液，置于恒温水浴摇床（37℃）中，在130 r/min条件下进行释放实验。每24 h用等体积新鲜缓冲液更换一次释放液，更换出的释放液用HPLC测定紫杉醇、强的松和肝素浓度，HPLC实验条件：反相C18色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5 m）；流动相为乙腈-水（50∶50，V/V）；流速为1.0 mL/min。紫杉醇、强的松和肝素检测波长分别为227 nm、240 nm、215 nm。分别以紫杉醇、强的松和肝素为外标对照品，采用外标一点法计算各物质含量，绘制累积释放曲线。

1.3 体外细胞实验

1.3.1 细胞原代培养 取人体废弃大隐静脉10～15 cm，PBS溶液洗去残血，0.1%的粗制胶原酶消化3～10 min，得到含内皮细胞的消化液，PBS溶液冲洗后离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，在37℃、5%的二氧化碳孵育箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

1.3.2 细胞存活率实验 MTT试剂盒测定细胞存活率。以104/孔密度接种于96孔细胞培养板，每孔200 μL，每组均设6个复孔。细胞贴壁后换无血清培养基作用24 h，使细胞同步于G0期，分别给予紫杉醇、紫杉醇+强的松和紫杉醇+强的松+肝素的相应血清加以刺激，于共同培养24、72 h终止，刺激结束后加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔，37℃，5% CO2孵育4 h，小心吸取上清，加入DMSO 150 μL/孔，充分混匀，在492 nm 波长下测定OD值，然后计算存活率。

1.3.3 乳酸盐脱氢酶释放试验 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测细胞LDH释放量，步骤概括如下：按5000 cell/孔将细胞悬浮液置入96孔板中，先用含5%FBS的RPMI 1640培养基100 μL培养24 h。24 h后96孔板试验孔换成含5%FBS和不同阶段纳米涂层（紫杉醇、紫杉醇+强的松和紫杉醇+强的松+肝素）的24 h或72 h RPMI 1640浸提液100 μL进行培养。加试剂盒工作液并避光30 min后于490 nm下测定OD值。乳酸脱氢酶（LDH）释放率=（处理样品OD-样品对照孔OD）/（最大酶活性OD-样品对照孔OD）×100%。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 17.0 统计学软件进行数据单因素方差分析，计量资料以均数±标准差表示，组间两两比较采用LSD法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 程序化药物释放纳米涂层的表征

程序化药物释放体系中紫杉醇、强的松和肝素的包封率分别为（75.7±4.2）%、（81.2±5.3）%和（97.3±4.6）%，载药量分别为（14.1±1.9）%、（9.3±1.6）%和（10.4±2.1）%，见表1。

表1 程序化药物释放体系中药物的包封率和载药量（x±s，%）

2.2 程序化药物体外释放实验

从图1可以看出，肝素、强的松和紫杉醇依次从载体中缓慢释放，在释放实验的第60天时，肝素的累积释放量达到96%，强的松的累积释放量达到55%，紫杉醇的累积释放量仅有8%。

2.3 程序化药物释放纳米涂层在血管内皮细胞的作用

对电纺丝逐步涂布紫杉醇、强的松和肝素，制备得到程序性释放纳米药物。从表2可知，紫杉醇涂布的纳米药物作用血管内皮细胞24 h，细胞存活率显著下降（P<0.05）；作用72 h后，细胞存活率降到空白组的45.2%（P<0.05），再涂布强的松后，内皮细胞存活率同样显著下降（P<0.05）；肝素涂布后，对内皮细胞也有类似作用。

此外，紫杉醇、紫杉醇+强的松和紫杉醇+强的松+肝素的不同涂布阶段纳米药物作用血管内皮细胞24 h后，细胞LDH释放率较空白组和阴性对照组均显著上升（P<0.05），分别为8.7%（P<0.05）、6.4%（P<0.05）和7.3%（P<0.05）；纳米药物作用72 h后，细胞LDH释放率分别达到15.6%、13.5%和13.9%，均显著高于空白组和阴性对照组水平（P<0.05）。

表2 程序化纳米药物对血管内皮细胞的影响（x±s，%）

注：阴性对照为空载纳米材料处理组；*表示与空白组相比，P<0.05； #表示与阴性对照组相比，P<0.05；LDH：乳酸脱氢酶

3 讨论

由于人口老龄化和饮食食谱的改变，动脉粥样硬化性导致的缺血性疾病发病率逐年升高。目前针对局部动脉狭窄的主要治疗手段是动脉旁路手术和经皮动脉腔内介入治疗。其中介入治疗创伤小、恢复快、患者易于接受，是目前各大医疗中心常用的治疗手段。上世纪70年代出现的经皮腔内冠状动脉成形术，是利用球囊直接扩张狭窄的动脉，改善血流供应，但术后管腔弹性回缩，局部平滑肌及细胞外基质增生会导致管腔再狭窄[9]，二次手术率高达30%～50%。80年代出现的血管内支架植入术，解决了管腔弹性回缩造成的术后管腔丢失，降低了再狭窄率，但仍存在管腔和管壁重构导致的支架内再狭窄，其6个月内再狭窄率约为20%左右[10]。近年来出现的药物洗脱支架，在支架支撑血管的同时，涂层中的药物能选择性地抑制内膜和平滑肌细胞过度增殖和迁移，更为有效地避免了血管再狭窄[11]。然而药物洗脱支架植入后仍有5%～10%的再狭窄率。目前研究认为，支架内再狭窄可能与凝血系统激活、局部炎症反应、血管再内皮化受阻、局部细胞外基质堆积以及平滑肌细胞的迁移与增殖有关，且是一个多因素相互影响的复杂过程[12]。另一方面，支架植入后随着时间的不同，支架局部组织的病理生理进程呈现出阶段性的变化。因此单独一种药物涂布的支架仅仅在某一阶段的某一方面改善血管再狭窄，这可能是现有药物洗脱支架植入后血管再狭窄的重要原因之一。

医用血管支架最常用的两种材料是可降解合金和可降解高分子材料[13，14]，前者具有良好的支撑性能，而高分子材料更加多样的结构特性和可控的降解速率得到更多关注。本研究采用了新型高分子材料聚己内酯和碳酸亚乙酯共聚物Poly（CL-co-EC）来构建药物涂层，经前期研究发现该材料在降解的同时能保持其整体性和支撑力，同时表现出了良好的生物相容性和理化性能[8]，而酸酐混纺使得该材料涂层提高了空隙率，增大了载药量和常温加药。不同比例CL和EC的共聚物具有不同的降解时间，本研究逐步将紫杉醇、强的松和肝素分别涂布于CL/EC=9、CL/EC=6和CL/EC=4的Poly（CL-co-EC）纳米载体中，构建出程序性释放纳米药物。

HPLC检测程序性纳米药物体外释放情况，结果与预期一致：肝素、强的松和紫杉醇分别先后缓慢释放，在实验结束时（第60天），肝素累计释放量达到96%，强的松达55%，紫杉醇最后释放，累计释放量达8%。肝素是一种抗凝剂[15]，其最先释放能起到抑制血小板聚集的作用，从而降低或推迟新生内皮的形成。强的松可以通过抑制结缔组织增生、降低毛细血管壁和细胞膜的通透性以抑制炎性反应[16]，本研究中强的松从第10天开始缓慢释放，以期能改善植入支架周围血管壁的炎性状态。肝素和强的松的共同释放均能抑制新生内膜的形成。紫杉醇能使细胞停留在G2/M期进而导致其死亡，是临床上被广泛使用的一种抗增殖药[17]。本研究中紫杉醇从第25天开始有少量释放，实验末期时累积释放量达10%。由于CL/EC=9的Poly（CL-co-EC）共聚物降解周期远超出60 d，预计紫杉醇在60 d之后的释放量将持续增加，这个过程可以抑制血管成纤维细胞的增殖。

本研究中构建的这种程序化释放药物以期在支架植入后不同阶段对抗支架局部组织的病理状态，第一阶段：肝素和强的松进行先期释放，起抗凝和抑制局部炎症的作用；第二阶段：强的松和紫杉醇的释放，抑制平滑肌细胞的迁移、增殖，抑制内膜过度增生；第三阶段：紫杉醇释放，抑制成纤维细胞增生和胶原合成。体外实验证实该研究中构建的程序化释放纳米涂层具有抑制血管内皮细胞生长的作用。而程序化药物释放纳米涂层支架在血管内的作用还有待进一步的动物实验来验证。

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（收稿日期：2014-08-14）

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（收稿日期：2014-08-14）