六味地黄汤对慢性肾衰大鼠肾组织中HIF—1α和PAI—1表达的影响

唐群等

[摘要] 目的 探讨六味地黄汤抗肾间质纤维化的作用机制。 方法 5/6肾切除法制备慢性肾衰模型，分假手术组、模型组、六味地黄汤组和依那普利组。六味地黄汤组予以6.25 g/（kg·d）六味地黄汤灌胃，依那普利组予以10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，假手术组和模型组予以10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，每天1次，连续灌胃12周。造模12周后，应用免疫组化法和RT-PCR法分别检测HIF-1α、PAI-1在肾组织中蛋白水平和基因表达。 结果 与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表达均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾组织中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表达均明显降低（P<0.05），且六味地黄汤组低于依那普利组（P<0.05）。 结论 六味地黄汤可能通过降低HIF-1α，进而下调PAI-1的表达抑制肾间质纤维化，且治疗效果优于依那普利。

[关键词] 肾纤维化；缺氧诱导因子1α；纤溶酶原激活物抑制剂-1；六味地黄汤

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）36-0009-04

Effects of six ingredient rehmannia decoction on expression of HIF-1α and PAI-1 in chronic renal failure rats

TANG Qun1 ZHANG Xi1 WU Hua2 CHEN Li1 LIU Chunyan1

1.Department of Pathology， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2.Furong Judicial Identification Center， the Second people's Hospital of Hunan Province， Changsha 410007， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of six ingredient rehmannia decoction against renal interstitial fibrosis. Methods The rat model of renal interstitial fibrosis were induced by 5/6 nephrectomy， rats were divided into sham operation group， model group， six ingredient rehmannia decoction group and enalapril group. Six ingredient rehmannia decoction group was given 6.25 g/（kg·d） of six ingredient rehmannia decoction gavage， enalapril group was given 10 mg/（kg·d） enalapril lavage， sham operation group and model group were given 10 mL/（kg·d） of distilled water， 1 times a day， continuous intragastric administration for 12 weeks. 12 weeks after modeling， immunohistochemical method and RT-PCR method were used to detect protein levels and gene expression of HIF-1α and PAI-1 in renal tissue respectively. Results Compared with the sham operation group， the renal tissue of HIF-1 α， PAI-1 protein level and gene expression were increased significantly in model group（P<0.05）； Compared with the model group， the renal tissue of HIF-1 α， PAI-1 protein levels and gene expression were decreased significantly in six ingredient rehmannia decoction group and enalapril group（P<0.05）， and the six ingredient rehmannia decoction group was better than that of enalapril group（P<0.05）. Conclusion Six ingredient rehmannia decoction can decrease the HIF-1 α， and down regulate the expression of PAI-1 inhibits renal interstitial fibrosis， and the treatment effect is better than that of enalapril.

[Key words] Renal fibrosis； Hypoxia-inducible factor 1α； Plaminogen activator inhibitor-1； Six ingredient rehmannia decoction

慢性肾脏病早期肾内普遍存在缺氧，且缺氧是导致肾间质纤维化的关键因素[1]。慢性肾脏病时，肾内缺氧可诱导缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表达增加，后者可上调一系列致纤维化靶基因的表达，从而促进肾纤维化进展[2]。纤溶酶原激活物抑制剂-1（plaminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是重要的促纤维化因子，且缺氧诱导的PAI-1基因表达受HIF-1α调控[3]。因此，本研究旨在通过对HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表达的检测，观察六味地黄汤是否能下调HIF-1α、PAI-1的表达，从而抑制5/6肾切除模型中大鼠肾间质纤维化的进展，为慢性肾脏疾病的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性SD 大鼠70只，鼠龄4～5周，体质量（180±20）g，饲养于湖南中医药大学SPF级动物房，动物合格证号：SCXK（湘）2009-0001。

1.1.2 药物制备 六味地黄汤（配方：熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g），由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。每剂药材75 g，每天煎一剂。药材先用相当于药材5倍量的自来水浸泡20 min，煮沸后再微火煮20 min，过滤得一煎液，剩余药渣再加少量蒸馏水，煎煮得二煎液，两煎液混合，3层纱布过滤后置水浴恒温器，浓缩至含生药1 g/mL。依那普利（湖南千金湘江药业股份有限公司，10 mg×16 s，国药准字H20066383），每片10 mg溶解于10 mL生理盐水，药液浓度为1 mg/mL。

1.1.3 主要试剂 一抗兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，二抗山羊抗兔IgG 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组化检测试剂盒、DAB 显色试剂盒购自武汉博士德公司，Trizol购自美国MRC公司，Taq DNA 聚合酶、dNTPs和RT 试剂盒均购自美国Fermentas公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模 SD 雄性大鼠70只，随机分为假手术组（10只）、模型组（20只）、六味地黄汤组（20只）和依那普利组（20只）。模型组、六味地黄汤组和依那普利组均在无菌条件下进行5/6肾切除术，0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，常规消毒、铺巾、剖腹、迅速切除左肾上、下极，明胶海绵压迫止血，复位肾脏，缝合肾脏各层组织。一周后切除对侧肾脏。假手术组仅打开腹腔暴露肾脏，但不切除。

1.2.2 给药 造模后第2天，六味地黄汤组予以六味地黄汤6.25 g/（kg·d）灌胃，依那普利组予以10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，假手术组和模型组以10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，1次/d，连续12周。大鼠在给药过程中途死亡者直接予以剔除。

1.2.3 标本收集 灌胃12周后，麻醉大鼠，剖腹，腹主动脉取血，代谢笼收集死前24 h尿量，肾组织一部分用10%甲醛固定，用于HE染色和免疫组化检测。另一部分保存于-80℃超低温冰箱，用于RT-PCR检测。

1.2.4 肾功能检测 Elisa法检测24 h尿白蛋白（24 h UAlb），酶法测定血肌酐（SCr）浓度，尿素酶-GLDH法测定尿素氮（BUN）浓度。

1.2.5 肾脏组织形态学检查 10%甲醛固定肾组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做4 μm厚连续切片，进行HE染色，显微镜观察各组大鼠肾组织病理变化。

1.2.6 免疫组织化学法检测 一抗分别用兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗体（工作浓度为1：50）和PAI-1多克隆抗体（工作浓度为1：100），二抗用相应山羊抗兔抗体（工作浓度按产品说明书配制为1：100），光学显微镜下观察每张切片，阳性呈黄色、棕黄色或棕褐色。高倍镜下（×400）随机选取5 个互不重叠的视野，计算机图像分析系统测定每个视野阳性染色的平均灰度值，半定量法评估，测得平均灰度值越小，表示免疫阳性程度越强。

1.2.7 RT-PCR检测 用Trizol法提取总RNA，首先在逆转录缓冲液中合成cDNA，然后PCR扩增目的基因HIF-1α、PAI-1以及内参基因β-actin片段。反应条件：94℃预变性5 min，循环采用94℃变性0.5 min，退火时间1 min，退火温度（HIF-1α：57.5℃，PAI-1：59℃），72℃延伸1 min，30个循环后，72℃延伸10 min，4℃存放。引物序列：HIF-1α 上游5-GTTTA CTAAAGGACAAGTCACC-3，下游5-TTCTGTTTGTTGAAG-GGAG-3；PAI-1上游5-GGCTTCATGCCCCACTTCTTC-3，下游5-ATTCACCAGCACCAGGCGTGT-3；β-actin上游5-ACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3，下游5-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，Tanon GIS 2020凝胶图像分析系统拍照，图像分析获得条带累积光密度数值，以β-actin为内参对照，计算HIF-1α/β-actin、PAI-1/β-actin比值，进行统计分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LDS法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐比较

模型组大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐较假手术组均明显升高（P<0.05）；而六味地黄汤组和依那普利组较模型组均明显降低（P<0.05），且六味地黄汤组降低更明显（P<0.05）。见表1。

表1 四组大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐比较（x±s）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与六味地黄汤组比较，cP<0.05

2.2 四组大鼠肾组织HE染色结果比较

假手术组肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐；模型组大部分肾小球硬化，肾小管萎缩、消失，部分管腔内可见蛋白管型，肾间质纤维化明显；六味地黄汤组和依那普利组肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化程度均有不同程度减轻，见图1。

图1 造模12周后四组大鼠肾组织HE染色结果比较（×400）

A假手术组；B模型组；C六味地黄汤组；D依那普利组

2.3 免疫组化结果比较

2.3.1 HIF-1α的表达 假手术组HIF-1α在大鼠肾组织内微量表达，模型组在大鼠肾小管上皮细胞胞浆、核内表达呈棕褐色；六味地黄汤组和依那普利组在大鼠肾小管上皮细胞胞浆、核内表达呈棕黄色或黄色，见图2。

2.3.2 PAI-1的表达 假手术组PAI-1在大鼠肾组织内微量表达；模型组表达量明显增加，肾小管上皮细胞胞核、刷状缘有棕褐色阳性颗粒；六味地黄汤组和依那普利组表达减弱，阳性颗粒呈棕黄色，见图3。

2.3.3 四组肾组织HIF-1α、PAI-1免疫阳性细胞半定量比较 见表2。模型组HIF-1α、PAI-1免疫阳性细胞半定量较假手术组明显降低（P<0.05）；六味地黄汤组和依那普利组HIF-1α、PAI-1免疫阳性细胞半定量较模型组升高（P<0.05），且六味地黄汤组升高更明显。免疫阳性细胞半定量越低，其蛋白表达越高，所以与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表达均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，而六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾组织中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表达均明显降低（P<0.05），且六味地黄汤组低于依那普利组（P<0.05）。

表2 四组大鼠肾组织HIF-1α、PAI-1免疫阳性细胞半定量比较（x±s）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与六味地黄汤组比较，cP<0.05

2.4四组肾组织HIF-1α、PAI-1 mRNA相对表达量比较

模型组HIF-1α、PAI-1 mRNA的表达较假手术组明显增加（P<0.05），而六味地黄汤组和依那普利组HIF-1α、PAI-1 mRNA的表达较模型组明显降低（P<0. 05），且六味地黄汤组降低更明显，见表3。

3 讨论

慢性肾功能衰竭（chronic renal failure，CRF）主要病理学特征为肾小球硬化和肾间质纤维化。慢性缺氧可导致肾小管间质损伤，促进肾间质纤维化[4]。缺氧主要通过HIF-1 及其氧敏感元件HIF-1α发挥作用[5]。因此，HIF-1α被认为是导致纤维化的关键因子[6]。已有研究表明，HIF-1α可调控促纤维化因子PAI-1的表达[7]， PAI-1是纤溶酶原激活物抑制剂（PAIs）的主要形式，PAIs是PAs的生理性特异抑制物。PA与PAI-1是细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）降解过程中保持蛋白质溶解与抗蛋白溶解间平衡的主要参与者。在组织内PAI-1水平升高和（或）活性增强，可抑制纤溶酶原激活物对ECM降解，引起ECM聚集，导致组织纤维化。

六味地黄汤出自北宋钱乙《小儿药证直诀》，为六味地黄丸改为汤剂，其由熟地黄、山萸肉、怀山药、牡丹皮、泽泻、茯苓六味药组成，主治肾阴虚证。六味地黄丸（汤）是临床上治疗肾阴虚证型慢性肾小球肾炎的有效方剂[8]。前期研究发现，六味地黄汤可明显改善5/6肾切除大鼠早期（造模后8周）肾功能和肾脏病理改变，减少肾组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白的积聚，从而延缓肾间质纤维化[9]。进一步研究还发现，六味地黄汤对5/6肾切除大鼠晚期（造模后12周）亦有很好的治疗效果。六味地黄汤可下调5/6肾切除大鼠肾组织中CTGF、PDGF-A、PDGF-B的表达，从而抑制肾间质纤维化[10，11]。但其对HIF-1α、PAI-1蛋白和基因表达的影响尚未阐明。

依那普利是血管紧张素转换酶抑制剂类药物，血管紧张素转换酶抑制剂不仅可通过降压、减少尿蛋白保护肾脏，还能通过减少肾小球细胞外基质的蓄积，减少肾间质纤维化和肾小球硬化，延缓肾损害进展。因此，本研究选用依那普利作为阳性对照药物。结果显示与模型组相比较，六味地黄汤组BUN、SCr及24 h尿蛋白均明显低于模型组，差异均有统计学意义，且肾脏病理学改变较模型组明显减轻，说明六味地黄汤可改善晚期慢性肾衰大鼠肾功能，减轻肾间质纤维化程度。与模型组相比较，六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾组织内HIF-1α、PAI-1的蛋白水平和mRNA表达明显升高和降低，且六味地黄汤组升高和降低更明显，差异均有统计学意义，说明两种药物均能抑制晚期慢性肾衰大鼠肾间质纤维化，且六味地黄汤的治疗效果优于依那普利。同时，提示六味地黄汤抗肾间质纤维化的作用机制可能与其下调肾组织内HIF-1α、PAI-1的表达有关。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-11-03）

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（收稿日期：2014-11-03）

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（收稿日期：2014-11-03）