厚朴酚对便秘型肠易激综合征大鼠5-HT 通路及肠道菌群的影响

刘 畅，王 潇，刘 芳*，张芮苑，傅超美*，付贤华，周 奇

[1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.平武县匡合厚朴种植专业合作社，四川 绵阳 622550；3.华润三九（黄石） 药业有限公司，湖北 黄石 435003]

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS） 是常见的功能性胃肠道疾病，临床多见于因胃肠蠕动障碍、肠道分泌紊乱等因素导致的持续性或间接性腹痛、腹胀及排便习惯、大便性状异常症状［1］。便秘型肠易激综合征（IBSC） 是其主要亚型之一，表现为无胃肠道器质性病变的胃肠动力和内脏感觉异常［2］。目前对IBS-C 的研究较少，其发病机制尚不明确。研究表明，IBS-C 的发生与5-HT 水平变化及肠道菌群都有着紧密联系［3-4］。5-HT 是广泛存在于大脑和消化道的重要神经递质，参与调节多项肠道运动和内分泌活动，其表达异常可导致多种胃肠道疾病的发生［5］；而肠道菌群作为庞大复杂的微生态系统，其菌群组成结构的改变也会影响产生胃肠道疾病［6］。

厚朴为木兰科植物厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.或凹叶厚朴M．officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮［7］，具下气除满、燥湿消痰之功，常用于治疗脘痞吐泻、食积气滞、痰饮喘咳及腹胀便秘等［8-9］。厚朴酚作为厚朴的主要有效成分之一，现代研究表明，厚朴酚在促进胃排空和肠推进、抗腹泻等方面都有显著作用［10］。课题组前期研究发现，厚朴酚对胃肠道疾病的治疗作用可能与5-HT 通路有关［11］。本研究建立IBS-C 大鼠模型，从5-HT 信号通路及肠道菌群角度探讨厚朴酚治疗IBS-C 的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠，24 只，体质量200～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （湘） 2019-0004］，饲养于成都中医药大学药学院［实验动物使用许可证号SYXK （川） 2020-124］，环境室温20～23 ℃，相对湿度50%，自然昼夜节律饲养，自由饮食饮水，适应性喂养1 周。

1.2 药物与试剂 厚朴酚（纯度≥98%，批号P1193536，上海阿达玛斯试剂有限公司），取厚朴酚粉末分散于纯化水中配制成4 mg／mL 的厚朴酚混悬液。5-HT、SP ELISA 试剂盒（批号78L4B82FT7、CRDEMXZ5JR，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；TRIzol （批号15596018，美国Invitrogen 公司）；EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-No Dye、5 × All-In-One MasterMix （批号 0194844830001、G492，上海爱必梦生物科技有限公司）。

1.3 仪器 PL-203 型电子天平［梅特勒托利多（上海）仪器有限公司］；JY92-IIn 型超声细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Neofuge 15R 型台式高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）；Epoch 型酶标检测仪（美国BioTek 公司）；SLAN-96S 型全自动医用PCR 分析系统（上海宏石医疗科技有限公司）；K2800 型核酸分析仪（北京凯奥科技发展有限公司）；FBZ2001-up-p 型标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司）；MX-F 型涡旋混合器（美国Scilogex 公司）；KH-Ⅲ型全自动研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；TL-420D 型水浴锅（江苏天力医疗器械有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 大鼠随机分为对照组、模型组及厚朴酚组，每组8 只，采用冰水混合物灌胃法建立IBS-C大鼠模型，大鼠每天准时灌胃给予0～4 ℃冰水混合物2 mL，造模共计14 d。造模时，每天灌胃前称量大鼠体质量，并记录每组大鼠粪便粒数，观察粪便形态硬度，检测粪便含水量。若见大鼠粪便坚硬、形状缩小、含水量减少，大鼠易激惹暴躁，可认为造模成功［12-13］。造模成功后厚朴酚组灌胃给予厚朴酚混悬液（40 mg／kg），对照组及模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1 次，连续12 d。

2.2 样本收集 给药结束后，收集大鼠粪便于灭菌冻存管中，液氮速冻后转移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（4 mL／kg） 麻醉［14］，腹主动脉取血后处死，收集结肠于灭菌冻存管中，液氮速冻后转移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。

2.3 大鼠排便情况测定 每天测定粪便颗粒数及粪便含水量。收集每组大鼠灌胃24 h 后的粪便，记录粪便颗粒数；使用电子天平称量粪便湿重，于105 ℃烘箱中烘干粪至恒重后称量干重，计算粪便含水率。公式为粪便含水率＝［（湿重-干重）／湿重］ ×100%。

2.4 大鼠结肠病理组织改变 取大鼠结肠组织，于10%甲醛溶液中固定，依次进行浸泡、脱水、包埋、均匀连续切片等操作后，行常规HE 染色，封片后于高倍显微镜下观察结肠组织病理变化情况。

2.5 结肠组织5-HT、SP 水平检测 取大鼠结肠组织，按照相应ELISA 试剂盒说明书检测结肠组织5-HT、SP 水平。

2.6 结肠组织TPH-1、SERTmRNA 表达检测 取大鼠结肠组织，采用TRIzol 法提取组织总RNA，采用逆转录-聚合酶链反应法检测结肠组织TPH-1、SERTmRNA 表达，根据各组CT值，运用2-ΔΔCT法计算mRNA 相对表达量。

2.7 肠道菌群16S rRNA 基因测序分析 根据E.Z.N.A.® soil 试剂盒说明书进行总DNA 抽提，DNA 浓度和纯度利用NanoDrop2000 进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量；用338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和806R （5'-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3'） 引物对V3-V4 可变区进行PCR 扩增，扩增程序为95 ℃预变性3 min，27 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min；使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2% 琼脂糖电泳检测；使用QuantiFluorTM-ST 进行检测定量；使用Miseq PE300 平台进行测序。

在QIIME2 平台将原始序列fastq 文件进行去噪拼接，得到了最终的特征序列表格［15］；运用QIIME2 featureclassifier 插件将97%相似度的序列进行OTU 聚类，并剔除所有污染性的线粒体和叶绿体序列，得到各组OTU 在微生物门、纲、目、科、属、种分类水平下的菌群数信息；通过菌群组成分析、α 多样性分析、β 多样性分析等方法对粪便肠道菌群进行解析［16］。

2.8 统计学分析 通过SPSSAU 软件进行处理，实验数据以（±s） 表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 厚朴酚对IBS-C 大鼠体质量的影响 如图1A 所示，各组大鼠体质量呈增长趋势。给药结束后，与对照组比较，模型组大鼠体质量降低（P＜0.01）；与模型组比较，厚朴酚组大鼠体质量略增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 厚朴酚对IBS-C 大鼠体质量（A）、粪便数（B） 及粪便含水率（C） 的影响（±s，n＝8）

3.2 厚朴酚对IBS-C 大鼠粪便数及含水率的影响 大鼠粪便数及含水率直观反应了IBS-C 模型造模成功与否及厚朴酚给药后的药效。如图1B～1C 所示，与对照组比较，给药前后模型组大鼠粪便数及含水率均降低（P＜0.01），说明IBS-C 模型造模成功；与模型组比较，给药后厚朴酚组大鼠粪便数及含水率均升高（P＜0.01）。

3.3 厚朴酚对IBS-C 大鼠结肠组织病理学改变的影响 如图2 所示，对照组、模型组和厚朴酚组大鼠结肠组织黏膜结构完整，未见明显黏膜炎症以及淋巴细胞浸润和间质水肿，说明IBS-C 模型及厚朴酚给药均未引起大鼠结肠组织炎症反应。

图2 厚朴酚对IBS-C 大鼠结肠组织病理学改变的影响

3.4 厚朴酚对IBS-C 大鼠结肠组织5-HT、SP 水平和TPH-1、SERTmRNA 表达的影响 如表1 所示，与对照组比较，模型组大鼠结肠组织5-HT、SP 水平升高（P＜0.05），TPH-1、SERTmRNA 表达无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，厚朴酚组大鼠结肠组织5-HT、SP 水平及SERTmRNA表达均升高 （P＜0.05），TPH-1 mRNA 表达无明显变化（P＞0.05），提示厚朴酚能通过调节5-HT 信号通路因子表达起到治疗IBS-C 的作用。

表1 厚朴酚对IBS-C 大鼠结肠组织5-HT、SP 水平和TPH-1、SERT mRNA 表达的影响（±s，n＝6）

表1 厚朴酚对IBS-C 大鼠结肠组织5-HT、SP 水平和TPH-1、SERT mRNA 表达的影响（±s，n＝6）

注：与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别5-HT／（ng·mL-1）SP／（pg·mL-1）TPH-1 mRNASERT mRNA对照组4.00±0.9729.93±9.881.00±0.001.00±0.00模型组9.72±1.29△△51.92±13.00△0.95±0.071.06±0.08厚朴酚组15.23±2.74**74.46±9.25*0.99±0.101.43±0.51*

3.5 厚朴酚对IBS-C 大鼠肠道菌群的影响

3.5.1 共有物种分析 提取粪便样品基因组DNA 并测序，共产生了1 675 718 条高质量序列。用QIIME 软件对原始测序数据进行处理，经同源比对和聚类分析，共获得6 448 个OTU。根据每组OTU 的分类结果绘制Venn 图，如图3 所示，所有组的共享OTU 总数为781 个，对照组特有OTU 数为1 171 个，多于模型组的987 个；经厚朴酚给药后，厚朴酚组有更多的特有OTU，为1 123 个。

图3 共有物种Venn 图

3.5.2 不同分类水平菌群丰度变化 如图4A 所示，在门水平上，各组大鼠粪便中菌群丰度排名前十的为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门 （Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）、变形菌门 （Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、非特异性细菌门（Unspecified Bacteria）、TM7、梭菌门 （Fusobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）。其中，对照组丰度排名前四的细菌门为厚壁菌门（63.41%）、拟杆菌门（24.90%）、螺旋体门（8.76%）、变形菌门（1.85%）；模型组为厚壁菌门（54.07%）、拟杆菌门（26.29%）、螺旋体门（12.13%）、变形菌门（4.22%）；厚朴酚组为厚壁菌门（61.53%）、拟杆菌门 （25.30%）、螺旋体门 （7.58%）、变形菌门（4.22%）。其中对照组厚壁菌门相对丰度占比超过50%，可以认为是优势菌种；而模型组厚壁菌门相对丰度占比降低（P＜0.05）；厚朴酚组厚壁菌门相对丰度占比趋于对照组。

图4 各组门水平（A） 及科水平（B） 上的物种相对丰度柱形图

如图4B 所示，在科水平上，各组大鼠粪便中菌群丰度排名前十的为乳酸菌科（Lactobacillaceae）、S24_7、螺旋体科（Spirochaetaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、毛螺旋体科（Lachnospiraceae）、Unspecified_Clostridiales、Paraprevotellac、Erysipelotrichaceae、Bacteroidaceae、Unspecified_Bacteroidales。其中，对照组丰度排名前四的细菌科为乳酸菌科（34.57%）、S24_7 （8.85%）、螺旋体科（8.76%）、瘤胃球菌科 （8.67%）；模型组为乳酸菌科 （29.90%）、S24_7 （9.00%）、螺旋体科 （12.13%）、瘤胃球菌科（8.09%）；厚朴酚组为乳酸菌科 （30.85%）、S24_7（11.05%）、螺旋体科（7.57%）、瘤胃球菌科（8.82%）。在科水平，各组间优势菌种变化差异不显著，但厚朴酚组螺旋体科相对丰度占比降低，菌群结构趋近于对照组。以上结果表明，厚朴酚能够调节IBS-C 大鼠肠道菌群，通过调节肠道菌群组成结构维持大鼠机体健康。

3.5.3 特征菌群差异性分析 图5 显示，LEfSe 分析采用线性判别分析（LDA 柱状图） 评估每个物种丰度对差异效果影响的大小。利用该分析（LDA＝3.0） 筛选出各组特征性菌属，对照组特征菌属为链球菌（Streptococcaceae）、链球菌（Streptococcus）；模型组特征菌属为变形菌、气单胞菌、琥珀酸弧菌、厌氧螺菌、变形杆菌；厚朴酚组特征菌属为梭状芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、ε-变形菌、曲杆菌、螺杆菌、螺杆菌、变形菌、脱硫弧菌、脱硫弧菌、脱硫弧菌。

图5 LEfSe 分析LDA 柱形图

3.5.4 α 多样性分析 稀释曲线是以测序数据量与物种多样性来构建的曲线，用来说明样品的测序数据量是否合理。曲线的平缓程度反映测序深度对观测样本多样性的影响，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性。图6 显示，提取的样本数量达标，并且测序数据的深度基本上包括了足够的样本种类。

图6 各组样本稀释曲线图

α 多样性指数通常评估某个样本的物种多样性，指数越高，表明样本的多样性越复杂。其中，Shannon、Simpson指数用于反映样本群落多样性，Chao1、Observed species 指数用于反映样本细菌群落丰富度。由表2 可知，与对照组比较，模型组各指数均无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，厚朴酚组Shannon、Simpson 指数升高（P＜0.05），Chao1、Observed species 指数无明显变化（P＞0.05）。结果表明，用冰水灌胃法制备IBS-C 大鼠模型对其肠道菌群的丰富度、多样性没有显著影响；厚朴酚主要干预肠道菌群的多样性，对群落丰富度无明显影响。

表2 α 多样性指数比较（±s，n＝8）

表2 α 多样性指数比较（±s，n＝8）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

组别ShannonSimpsonChao1Observed species对照组6.15±0.390.94±0.02618.93±91.1333.89±6.00模型组6.19±0.260.94±0.02614.82±60.4832.99±5.29厚朴酚组6.74±0.34*0.96±0.02*657.57±76.0435.81±7.25

3.5.5 β 多样性分析 β 多样性分析是对不同样品间的微生物群落构成进行比较。无度量多维标定法（NMDS） 统计是一种适用于生态学研究的排序方法，类似于PCoA。NMDS 为非线性模型，其能克服线性模型排序方法（如PCoA） 的缺点，更好地反映生态学数据。图7 为基于Unweighted Unifrac 距离进行的NMDS 分析，结果显示，对照组、模型组及厚朴酚组未明显分离，但厚朴酚组大鼠菌群结构更靠近对照组。

图7 各组样本NMDS 模型图

4 讨论

4.1 厚朴酚对IBS-C 大鼠5-HT 信号通路的影响 IBS-C 作为临床常见的消化道疾病之一，其病理基础主要包括胃肠动力障碍及内脏感觉异常等［17］，由于病症较轻微、病程长且反复发作等原因，困扰着许多人的生活。5-HT 是5-HT信号通路的核心，它既是神经递质，又是胃肠激素，绝大部分5-HT 都存在于胃肠道内，其主要功能包括促进胃肠道的运动、血管舒张及胰液的分泌等［18］。有研究表明，5-HT分泌的增多能促进肠道平滑肌蠕动收缩，从而改善IBS-C患者便秘症状［19］。SP 同样拥有胃肠激素和神经递质双重属性，可以促进肠道蠕动，并诱导5-HT 的释放［20］。5-HT 合成限速酶TPH-1 主要在EC 细胞表达，主要催化EC 细胞中的色氨酸反应生成5-HT，是合成5-HT 的重要指标［21］。单胺类转运体SERT 是与5-HT 有高度亲和力的跨膜转运蛋白，主要任务为回收5-HT，终止其作用，从而使得胃肠道的5-HT 水平减少，作为5-HT 失活最关键的蛋白，SERT 是影响5-HT 信号通路的重要指标之一［22-23］。

本实验结果表明，模型组大鼠粪便粒数及含水率减少，结肠组织5-HT 及SP 水平上升，推测原因为5-HT 过量导致5-HT4R 脱敏，引发胃肠运动障碍所致［5］。厚朴酚给药后，大鼠粪便粒数及含水率升高，5-HT 及SP 水平进一步上升，SERTmRNA 表达上调，提示厚朴酚能促进5-HT 及SP 分泌，提高5-HT 受体敏感度，并且可以通过调节SERT表达来调控5-HT 水平，进而影响5-HT 信号通路发挥促进调节胃肠蠕动的作用，其中厚朴酚能促进5-HT 水平这一结果与前期研究一致［11］。

4.2 厚朴酚对IBS-C 大鼠肠道菌群的影响 人体肠道是一个庞大复杂的微生态系统，细菌间通过相互作用参与机体的生长发育过程，维持肠道微生态平衡与机体稳定，许多疾病如IBS-C 等的发生发展也与菌群的变化有着直接或间接的影响［24-25］。本实验中，共有物种分析表明，与对照组比较，模型组特有OTU 数减少；厚朴酚给药后，特有OTU数增加，且LDA≥3 的特征菌属种类增加，提示厚朴酚可能通过增加特征菌属种类实现对IBS-C 的治疗。门水平菌群差异性分析表明，各组菌群的总体菌群物种组成没有差异；而模型组厚壁菌门相对丰度低于对照组及厚朴酚组，有害菌群螺旋体门相对丰度增加；厚朴酚给药后菌群结构趋近于对照组，提示厚朴酚治疗IBS-C 的机制可能与其调节菌群结构组成比有关。其中厚壁菌属能参与如丁酸盐、乙酸盐在内的短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA） 等成分的代谢合成，达到抗炎和抑制免疫等作用［26-27］。有研究表明，SCFA 作为肠道菌群的主要代谢产物之一，可以促进结肠5-HT 水平升高，增强胃肠运动能力［28-30］，这与本研究发现厚朴酚组促进5-HT 水平上升的结果吻合。本研究结果显示，模型组大鼠菌群丰富度、多样性均无明显变化；厚朴酚组菌群多样性增加，且β 多样性分析结果也显示厚朴酚组大鼠菌群结构更靠近对照组，但与模型组未明显分离，提示由于IBS-C 模型大鼠肠道无质性病变和炎症反应，其对大鼠菌群的改变主要为紊乱菌群组成结构比例，对菌群多样性及丰度影响不显著，且无明显致病菌滋生，而厚朴酚主要通过调整、改善菌群构成，降低有害菌种比例及干预菌群多样性到达治疗效果。

综上所述，厚朴酚可通过改善肠道菌群结构，调节5-HT 通路，从而发挥治疗IBS-C 的作用。