舒肝利胆浓缩丸提取工艺优化

李俊江，徐志伟，毕映燕，李季文，杨小源

（甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000）

慢性胆囊炎是临床常见慢性胆道系统疾病之一，主要症状包括恶心、腹胀、呕吐、嗳气、厌食油腻、右上腹反复疼痛等［1］，西医治疗重在缓解炎症、促进排石，效果明显但难以根治，同时伴有较多副作用［2-3］。中医认为，慢性胆囊炎属“胆胀” “胁痛” 范畴［4］，若胆气不降、脏腑郁滞不通则易诱发胆腑胀满、疼痛等诸多不适症状［5］，治疗时侧重疏肝理气、通腑利胆。

舒肝利胆方为甘肃省中医院协定方，由醋柴胡、金钱草、白豆蔻、荆芥等13 味中药组成，具有疏肝理气、清热祛湿、利胆止痛功效，临床上治疗慢性胆囊炎多年。为了促进舒肝利胆方临床使用范围，更好地服务于患者，本实验拟将该方制成临床疗效显著、丸剂载药量多、稳定性好、服用方便的浓缩丸。

CRITIC-AHP 复合加权法综合了层次分析法（AHP）、基于指标相关性的权重确定方法（CRITIC） 的优越性，既可保持权重稀释的稳定性，又能较好地区分数据信息［6］。因此，本实验采用该方法结合Box-Behnken 响应面法优化舒肝利胆浓缩丸提取工艺。

1 材料

1.1 仪器 A-10 型高效液相色谱仪（美国PerkinElmer 公司）；LX2200C 型（0.01 g）、LX120A 型（0.000 1 g） 电子分析天平（瑞士普利赛斯公司）；HWS26 型电热恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；HXGZ-000800 型电热恒温干燥箱、KQZ3200E 型超声波清洗机（连云港医疗器械设备厂）。

1.2 试剂与药物 柴胡、金钱草、豆蔻、紫苏子、白芥子、甘草、大枣、干姜等药材均购自甘肃康乐药业有限责任公司，经甘肃省中医院杨小源主任中药师鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》 一部规定。甘草苷 （批号111610-201607）、迷迭香酸（批号111871-201706）、橙皮苷（批号110721-201818）、槲皮素（批号100081-201610）、柴胡皂苷a （批号20736-09-8） 对照品均购自中国食品药品检定研究院（纯度≥98%）。甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 指标成分含量测定 采用HPLC 法。

2.1.1 供试品溶液制备 精密量取提取液10 mL，蒸干，甲醇定容至25 mL 量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，甲醇定容至10 mL 量瓶中，摇匀，即得（各成分质量浓度分别为甘草苷2.16 mg／mL、迷迭香酸4.12 mg／mL、橙皮苷2.05 mg／mL、槲皮素0.08 mg／mL、柴胡皂苷a 2.12 mg／mL）。

2.1.3 阴性样品溶液制备 按本品处方比例，制成缺甘草、紫苏子、枳壳、金钱草、柴胡的阴性样品，按“2.1.1” 项下方法制备，即得。

2.1.4 色谱条件 Waters Symmetry Shield RP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），DAD 检测器；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸 （B），梯度洗脱 （0～12 min，17% A；12～18 min，17%～22%A；18～24 min，22%～30%A；24～32 min，30%～38% A；32～45 min，38%～80% A；45～55 min，80%～17%A）；体积流量1 mL／min；柱温20 ℃；检测波长0～18 min 237 nm，18～24 min 283 nm，24～28 min 330 nm，28～35 min 368 nm，35～55 min 210 nm；进样量10 μL。

2.1.5 系统适用性考察 精密量取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度良好，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.1.6 线性关系考察 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液适量，稀释成6 个质量浓度，在“2.1.4” 项色谱条件下各进样测定10 μL。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程分别为甘草苷Y＝0.401 2X-0.287 7，线性范围0.216 1～2.160 3 mg／g；迷迭香酸Y＝1.913 6X-1.370 4，线性范围1.036 6～10.311 6 mg／g；橙皮苷Y＝0.380 8X-0.270 1，线性范围0.205 4～2.053 2 mg／g；槲皮素Y＝0.001 5X-0.000 8，线性范围0.000 8～0.008 1 mg／g；柴胡皂苷aY＝1.182X-0.853 4，线性范围0.636 6～6.363 1 mg／g。

2.1.7 精密度试验 精密量取同一份供试品溶液10 μL，同一天内在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定6 次，计算日内精密度；隔天取置于冰箱中冷藏的同一份供试品溶液适量，连续2 d 在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，每天3次，计算日间精密度，测得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 日内精密度RSD 分别为1.03%、1.01%、1.02%、1.05%、1.03%，日间精密度RSD 分别为1.11%、1.13%、1.16%、1.07%、1.09%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 取同一份本品，按“2.1.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，测得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量RSD 分别为1.33%、0.51%、1.37%、0.69%、1.17%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 稳定性试验 取同一份供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，测得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面积RSD 分别为1.38%、1.04%、0.22%、1.41%、0.71%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.10 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的供试品溶液9 份，随机分为3 组，分别精密加入80%、100%、120%水平对照品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 平均加样回收率分别为101.14%、98.92%、101.15%、99.51%、99.98%，RSD 分别为0.12%、0.76%、1.10%、1.02%、0.54%。

2.2 干浸膏得率测定 精密量取按最优工艺提取的供试品溶液10 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷却，精密称定质量，计算得率。

2.3 单因素试验

2.3.1 浸泡时间 按处方比例平行称取药材6 份，加10倍量水分别浸泡0～240 min 后提取90 min，浓缩至70 mL，测定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最终，分别选择30、60 min 作为后续优化研究中的最低、最高水平值。

2.3.2 提取时间 按处方比例平行称取药材6 份，加10倍量水，以30 min 为节点分别提取0～180 min，浓缩至70 mL，测定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最终，分别选择60、120 min 作为后续优化研究中的最低、最高水平值。

2.3.3 提取次数 按处方比例平行称取药材6 份，加10倍量水分别提取1、2、3 次，每次90 min，将提取2 次以上者浓缩至70 mL，测定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。结果，提取3 次时各成分含量最高，并与提取1、2 次时相比有明显差异，故最终选择3 次，并不再进行优化。

2.3.4 加液量 按处方比例平行称取药材6 份，分别加入6～16 倍量水提取60 min，浓缩至70 mL，测定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最终，分别选择8、12 倍作为后续优化研究中的最低、最高水平值。

2.4 指标权重确定 参考文献［7-9］ 报道。

2.4.1 CRITIC 法 该方法以标准差σj体现对比强度，指标间相关性Rj体现冲突性，公式为其中rij表示评价指标i、j之间的相关系数；Cj表示第j个指标的信息量，公式为Cj＝＝σjRf（j＝1，2，3，4，5，6，7，…），其数值越大，第j个指标信息量、相对重要性也越大，客观权重Wj公式为Wj＝

以公式指标成分值＝［（实测值-最小值）／（最大值-最小值）］ ×100 计算对比强度（σj）、冲突性（Rj）、综合权重（Cj）、客观权重（Wj），得柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率客观权重分别为0.142 5、0.209 4、0.142 7、0.123 2、0.193 6、0.188 6。

2.4.2 AHP 法 综合考虑药味配伍规律、含量、药理作用等方面，以量化的柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率为权重指标，分成6 个层次，依次为柴胡皂苷a 含量、槲皮素含量、迷迭香酸含量、橙皮苷含量、甘草苷含量、干浸膏得率，构建成对比较的优先判断矩阵，见表1。

表1 各指标成对比较的优先判断矩阵

最终，经层次分析后柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率权重系数分别为0.380 6、0.251 6、0.160 2、0.100 9、0.064 3、0.042 5，一致性比列因子（CR）＝0.02＜0.10，即各指标优先判断矩阵的一致性均符合要求。

2.4.3 CRITIC-AHP 复合加权法 在“2.4.1” “2.4.2” 项下结果基础上计算复合权重ω复合ij，公式为ω复合ij＝ωAHPij ωCRITICij／∑ωAHPijωCRITICij，得柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率复合权重分别为0.333 4、0.323 9、0.140 5、0.076 4、0.076 5、0.049 3。

2.5 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上，以浸泡时间（A）、提取时间（B）、加液量（C） 为影响因素，柴胡皂苷a （Y1）、槲皮素（Y2）、迷迭香酸（Y3）、橙皮苷（Y4）、甘草苷（Y5） 含量及干浸膏得率（YG） 为评价指标，按“2.4.4” 项下方法计算综合评分 （Y），结果见表2。

表2 试验设计与结果

采用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行二次多元回归拟合，得方程为Y＝81.62+20.15A-0.12B-15.69C+6.43AB+8.53AC+19.71BC-21.29A2+2.23B2-16.82C2，相关系数为0.996 9，校正系数为0.990 8，表明模型拟合度好，试验误差小，方差分析见表3。由此可知，各因素影响程度依次为浸泡时间（A） ＞加液量（C） ＞提取时间（B），响应面分析见图2。最终确定，最优工艺为药材浸泡45 min 后加10倍量水提取3 次，每次90 min。

表3 方差分析

图2 各因素响应面图

2.6 综合评分比较 分别采用CRITIC 法、AHP 法、CRITIC-AHP 复合加权法计算权重系数，并对其进行综合评分，结果见表4。再计算相关系数，得CRITIC 法、AHP 法该数值为0.952，CRITIC 法、CRITIC-AHP 复合加权法该数值为0.946，AHP 法、CRITIC-AHP 复合加权法该数值为0.999，表明3 种方法有显著相关性（P＜0.05），评分具有一致性；CRITIC 法、AHP 法该数值为0.178，无显著相关性（P＞0.05），表明所反映的信息不具有叠加性。

表4 各方法所得综合评分（分）

2.7 验证试验 按处方比例平行称取药材6 份，按“2.5”项优化工艺进行3 批验证试验，测得综合评分分别为98.91、99.02、98.88 分，平均值为98.94 分，RSD 为0.074 5%，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 评价指标选择 舒肝利胆浓缩丸中主要成分均为对应药味的2020 年版《中国药典》 检测指标或重要活性物质，其中柴胡皂苷a 具有抗肿瘤、抗肝毒、抗病毒、抗高血脂、抗内毒素、抗过敏、抗细胞黏附等作用［10］；槲皮素具有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性等作用［11］；迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性［12］；橙皮苷可降低毛细血管脆性，增强毛细血管韧性［13］；甘草苷具有抗氧化、抗衰老、抗纤维化、抗哮喘、抗肝损伤、抗肝癌作用［14］。因此，本实验选择上述成分进行含量测定。

3.2 权重系数计算方法选择 CRITIC 法是利用评价指标本身标准偏差和相关系数来综合衡量相关权重的客观赋权方法，虽然所得权重系数受人为因素影响较少，但指标之间的轻重关系易忽视。AHP 是基于层次分析结合数学逻辑思维来分析多个目标信息，计算相对于上一层信息的本层信息权重比例的主观赋权方法，但其所得权重系数主观性较强，而且易忽视评价指标本身的客观数据信息。CRITICAHP 复合加权法结合上述2 种方法优势，既可保持权重系数的稳定性，又能较好地区分数据信息，本实验采用该方法优化舒肝利胆浓缩丸提取工艺，其简便可行，质量稳定，可为该制剂后期制备提供参考［15-16］。