基于UPLC 指纹图谱和化学计量学的不同熏硫程度白芷质量评价

陈文莉，李 蕊，陈瑞鑫，郭佳晨，蒋桂华

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学，西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；3.成都中医药大学国学院，四川 成都 611137）

白芷始载于《神农本草经》，其性温味辛，归胃、肺、大肠经，具有解表散寒、祛风止痛等功效，临床常用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛等症［1］。白芷富含挥发油类、香豆素类、多糖类、黄酮类、生物碱等成分［2-4］。现代研究表明，白芷及其主要活性成分对神经系统疾病如惊厥、偏头痛、抑郁、止疼等有较好的缓解或治疗作用［5-7］。

2020 年版《中国药典》 收载的白芷成方制剂有八十多个，《中医方剂大辞典》 中收录的白芷方剂高达3 887 个［8］。目前市场上的白芷按产地主要分为川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳白芷；其中川白芷的产量较大，质量上乘；杭白芷近年来基本不再种植；祁白芷、禹白芷产量较小主要供地方使用；亳白芷近年发展迅猛，产量占有较大，市场上多做香料使用。白芷产地加工方式多为硫磺熏蒸，具有易干燥、不易生虫、经济简易等优势。但现有研究表明，硫磺熏蒸后药材有效成分含量损失、药效降低、药材质量受到严重影响［9-11］。2020年版《中国药典》 规定白芷二氧化硫残留量不得超过150 mg／kg，但课题组前期调研一百余批白芷样品后发现，熏硫白芷二氧化硫残留量差异较大，除2 批药材符合规定外，其余样品的二氧化硫残留量超过规定几倍甚至十几倍，这可能是不同熏硫程度所导致。2020 年版《中国药典》 仅以欧前胡素含量作为白芷质量控制的标准较为单一，无法体现不同熏硫白芷药材的内在质量差异［12］。

综上所述，白芷为药食同源药材，使用量较大，不同熏硫程度白芷在市场上流通售卖，药材质量参差不齐，不利于市场监管，也限制了白芷产业的发展。目前针对不同熏硫程度白芷的质量研究尚显空白，因此本研究拟建立不同熏硫程度白芷UPLC 指纹图谱方法，筛选出不同熏硫程度白芷差异性标志物；并测定其3 种主要成分含量，以期为熏硫白芷质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Ultimate 3000 超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；SQP 万分之一电子分析天平、BT125D 十万分之一电子分析天平（德国Sartorius 公司）；KQ-300 型超声波清洗机（昆山市超声设备有限公司）；SHZ-D （Ⅲ） 循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；Milli-Q 超纯水器（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 欧前胡素 （批号MUST-20031810）、佛手柑内酯（批号MUST-20053001）、水合氧化前胡素（批号MUST-20101314）、异欧前胡素 （批号MUST-20032420）、珊瑚菜素 （批号MUST-21060301） 对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司；白当归素（批号AF9021403）、氧化前胡素（批号AF9021403） 购于成都埃法生物科技有限公司，所有对照品纯度均大于98%。乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；冰乙酸（色谱纯，成都市科隆化学品有限公司）；其余试剂为分析纯；水为超纯水。

定点收集33 批四川遂宁不同熏硫程度的白芷药材，经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为杭白芷Angelicadahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.） Shan et Yuan 的干燥根，样品信息见表1。

表1 样品信息Tab．1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 月旭Xtimate UHPLC C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%乙酸（B），洗脱程序见表2；体积流量0.35 mL／min；柱温35 ℃；检测波长305 nm；进样量3 μL。

表2 梯度洗脱程序Tab．2 Procedures for gradient elution

2.2 供试品溶液制备 取白芷粉末（过4 号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声处理（300 W，50 kHz）1 h，静置放冷后称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备 取白当归素、氧化前胡素、异欧前胡素、欧前胡素、珊瑚菜素、佛手柑内酯、水合氧化前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇稀释成质量浓度分别为81.0、75.0、80.0、87.0、80.0、75.0、93.0 μg／mL 的对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取“2.3” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，以欧前胡素（9 号峰） 为参照峰，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 值均小于1%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取白芷粉末（S6） 适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以欧前胡素（9 号峰） 为参照峰，测得各共有峰的相对保留时间RSD 值均小于1%，相对峰面积RSD 值均小于2%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取白芷粉末（S6） 适量，按“2.2” 项下方法平行制备供试品溶液6 份，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以欧前胡素（9 号峰） 为参照峰，测得各共有峰的相对保留时间的RSD 值均小于1%，相对峰面积的RSD 值均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.5 UPLC 指纹图谱的建立 将33 批白芷按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。原始数据以txt 文件格式导出后，导入Origin 2018 软件进行绘图。色谱图见图1。供试品色谱图与对照品色谱峰进行比对，指认出7 种成分，分别为水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素，见图2。

图1 不同熏硫程度白芷药材UPLC 指纹图谱Fig．1 UPLC fingerprints for differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

图2 各成分UPLC 色谱图Fig．2 UPLC chromatogran of various constituents

2.6 相似度评价 将33 批白芷样品色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 （2012版） 》，以S6 为参照，计算相似度，结果见表3。不同熏硫程度白芷样品色谱图与参照图谱的相似度为0.735～0.997。结果显示，无硫和低硫白芷相似度均高于0.950；中硫白芷除S32 外，相似度均低于0.950；高硫白芷除S33 外，相似度均低于0.900。表明不同熏硫程度白芷质量差异较大，通过相似度评价可以进行初步区分。

表3 不同熏硫程度白芷指纹图谱相似度结果Tab．3 Results for fingerprint similarity of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

2.7 聚类分析 采用SPSS 26.0 软件，以11 个共有峰的峰面积为变量，采用组间联接的聚类方法，以欧式距离为样品距离进行聚类，结果见图3。在度量距离为25 时，白芷样品整体分为2 类；当度量距离为17 时，白芷样品被分为3 类，S1～S13 无硫和低硫白芷聚为Ⅰ类，S14～S18 中硫白芷聚为Ⅱ类，S19～S33 聚为Ⅲ类。结果表明，聚类分析有分类趋势，同一熏硫程度的白芷大多被聚为一类，但也存在部分样品分类不准确的现象，因此需要引入有监督的模式识别。

图3 不同熏硫程度白芷药材聚类分析树状图Fig．3 Dendrogram of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

2.8 主成分分析 将33 批白芷共有峰峰面积导入SPSS 26.0 软件，以共有峰峰面积为变量进行主成分分析。提取标准为特征值大于1，结果见表4。共提取3 种主成分，方差贡献率、累计贡献率为84.403%，表明这11 个共有峰可代表白芷指纹图谱的大部分信息。

表4 主成分分析特征值和方差贡献率Tab．4 PCA eigenvalues and variance contribution rate

主成分载荷矩阵反应了各峰对主成分的贡献大小；其绝对值越大，表明该峰对主成分的贡献越高，主成分因子载荷矩阵结果可见表5。由表5 可知，峰9 （欧前胡素）、峰6 （佛手柑内酯）、峰10（珊瑚菜素） 对第一主成分有较大的贡献值。

表5 主成分因子载荷矩阵Tab．5 Principal component load

采用SIMCA 14.1 软件，对33 批白芷样品进行主成分分析，提取了4 种主成分建立PCA 模型，结果见图4。模型解释参数R2X为0.919，表示提取的主成分可解释91.9% 的原始变量，模型预测参数Q2为0.709。样品总体可分为4 类，与聚类分析结果不一致，在聚类分析的基础上可将无硫白芷区分开来；表明不同熏硫程度白芷化学成分含量存在一定差异，且该模型预测性良好，可以实现不同熏硫程度白芷的区分。

图4 不同熏硫程度白芷的PCA 散点图Fig．4 PCA score plot of differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

2.9 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 为进一步寻找引起不同熏硫程度白芷差异的标志物，将共有峰数据导入SMICA 14.1 软件，建立模型，OPLS-DA 得分散点图见图5。白芷模型解释率参数R2X为0.840，R2Y为0.788，预测参数Q2为0.806，均大于0.5 且接近1，表明建立的模型稳定可靠。

图5 不同熏硫程度白芷的OPLS-DA 得分散点图Fig．5 OPLS-DA analysis results of differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

为防止模型过度拟合造成假阳性结果，采用置换检验（n＝200） 对模型进行验证，置换检验图见图6。结果显示，白芷检验参数R2＝（0.0，0.056），Q2＝（0.0，-0.34），R2均小于0.40，Q2均小于0.05，表明所建模型拟合良好。

图6 不同熏硫程度白芷的OPLS-DA 置换检验图Fig．6 OPLS-DA permutation test of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

OPLS-DA 模型中变量重要性投影值（VIP 值）可直观反映出具有统计学意义的差异标志物；VIP值越大，表明其对组间差异的影响权重越大。以VIP 值大于1 为阈值，筛选出5 个共有峰，见图7，分别为峰1、峰8、峰7 （氧化前胡素）、峰5、峰3 （水合氧化前胡素）；表明这些化合物可能是影响不同熏硫程度白芷质量差异的标志物。

图7 11 个共有峰VIP 值Fig．7 VIP values of eleven common peaks

2.10 主成分含量测定

2.10.1 线性关系考察 精密称取欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为184、86、86 μg／mL 的对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、3、6、12、15、18 μL，在“2.1” 色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表6，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表6 各成分线性关系Tab．6 Linear relationships of various constituents

2.10.2 精密度试验 取“2.10.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素峰面积RSD 分别为0.26%、0.91%、0.76%，表明该仪器精密度良好。

2.10.3 重复性试验 取白芷粉末（S6） 6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素峰面积RSD 分别为0.54%、0.66%、0.90%，表明该方法重复性良好。

2.10.4 稳定性试验 取白芷粉末（S6） 适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、3、6、9、12、18、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素峰面积RSD 分别为0.15%、0.15%、0.92%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的白芷粉末（S6） 0.5 g，精密称定，按对照品与样品1 ∶1 的比例，加入欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素对照品，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素平均加样回收率为100.93%、98.36%、96.78%，RSD 分别为2.72%、1.85%、2.32%，见表7。

表7 各成分加样回收率结果（n＝6）Tab．7 Results of recovery rates for various constituents（n＝6）

2.10.6 含量测定 取33 批白芷，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表8。

表8 各成分含量测定结果（mg／g，n＝3）Tab．8 Results of content determination for various constituents （mg／g，n＝3）

3 讨论

目前，白芷HPLC 指纹图谱或一测多评研究较多［13-14］，但采用超高效液相色谱的研究较少。因此，选择超高效液相色谱技术进行研究，一方面是为填补空白，其次是为缩短进样时间提高检测效率。本研究建立了不同熏硫程度白芷UPLC 指纹图谱方法，标定了峰面积较高的11 个共有峰，指认了7 个共有峰，在已有的基础上丰富了不同熏硫程度白芷的共有成分［15-17］；同时，通过OPLS-DA 分析筛选出5 种差异性成分，并用对照品比对出氧化前胡素、水合氧化前胡素可作为不同熏硫程度白芷的质量差异物。2020 年版《中国药典》 “白芷”含量测定仅以欧前胡素为指标较为单一，建议后续可以增加其他共有成分或差异性成分作为测试指标，以利于更加科学的评价白芷质量。已有文献报道白芷熏硫后损失最大的是氧化前胡素，其次为水合氧化前胡素［18］，与本研究结果一致，能评价不同熏硫程度白芷的整体质量。

含量测定结果显示，33 批白芷药材的3 种主要成分（欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素） 的含量在0.864～4.791 mg／g 之间。其中，无硫白芷的这3 种成分总含量最高，而高硫白芷的总含量最低；这可能是熏硫过程中硫磺使用量过大、熏硫时间过长所导致的有效成分含量降低。中药成分复杂，不同加工方式将会影响药材质量，因此通过多指标的含量测定来评价药材质量是十分有必要的。

2020 年版《中国药典》 中除对山药、天冬、天花粉、天麻、牛膝、白及、白术、白芍、党参、粉葛共10 味药材及其饮片“二氧化硫残留量” 检查限度标准为400 mg／kg 外；其余中药材及饮片二氧化硫残留量不得超过150 mg／kg。彭月［19］对市购的山药、葛根、黄芪、党参等88 批药材的二氧化硫残留量进行测定，与限度标准对比，仅约四分之一的样品符合限量要求。硫磺熏蒸最初用以防腐防虫达到利于贮藏的目的，现在部分不良商家滥用硫磺熏蒸用于药材漂白，严重影响药材用药安全［20］。本研究以白芷为例，运用指纹图谱结合化学模式识别的方法对不同熏硫程度白芷样品进行质量评价研究，也为其他熏硫药材的评价提供参考。