隐丹参酮滴丸制备及其体内药动学研究

马 霄，颜国华，王世广，李晓婷，李登云，崔传锋

（1.郑州工业应用技术学院，河南 郑州 451150；2.中国医药工业研究总院有限公司，上海 201203）

隐丹参酮属于二萜醌类化合物，主要存在于丹参等植物中［1］，具有抗肿瘤、抗病毒、保肝、抗心绞痛等药理作用［2］，对脑卒中、脑缺血、阿尔茨海默病等疾病疗效较强［3-4］，并且本身毒性较小［5］。但该成分在水中的溶解度仅为 （0.96±0.05） μg／mL，油水分配系数logP值为1.78［6］，虽然在模拟胃液中的稳定性良好，但在模拟肠液中会发生降解［7］，导致其口服生物利用度仅约为2%［8］。另外，将中药活性成分制成口服给药制剂时，作用机制明确，易获得现代科学理论支撑，从而为其走向国际市场奠定基础［9］。

目前，隐丹参酮相关制剂有纳米结构脂质载体［10］、固体脂质体［11］、纳米混悬剂［12］、固体分散体［13］等。由于滴丸可增加药物溶解度、溶出度、生物利用度［14-15］，并且生产成本低，故本实验制备隐丹参酮滴丸，并考察其体内药动学，以期为临床提供成本低、疗效好的相关制剂。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DW-1 型全自动滴丸机（广州市大祥电子机械设备有限公司）；FA2004B 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；HJ-6A 型磁力搅拌仪（常州德杜仪器有限公司）；RC12AD 型智能溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）；MDS-DCY12Q 型氮吹仪（深圳迈德施生物科技有限公司）。

隐丹参酮 （批号 110852-210126，纯度99.0%）、非诺贝特 （批号100733-202006，纯度99.9%） 对照品（中国食品药品检定研究院）。隐丹参酮原料药（批号201017，纯度96.5%，南京普怡生物科技有限公司）。聚乙二醇4000 （PEG 4000，批号20200618，天津市光复精细化工研究所）；二甲基硅油 （型号 H201-50，批号20200316，国药集团化学试剂有限公司）。

家兔，体质量1.5～2.0 kg，雌雄兼具，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK（豫） 2020-0001，实验室适应1 周。

2 方法与结果

2.1 隐丹参酮含量测定

2.1.1 色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.02% 磷酸（65 ∶35）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。

2.1.2 供试品溶液制备 取20 粒本品，置于研钵中研细，取约40 mg 至三角烧瓶中，精密称定，加入70% 乙醇50 mL，称定质量，超声 （功率250 W） 处理20 min，静置20 min，70%乙醇补足减失的质量，过0.45 μm 微孔滤膜，精密量取2 mL续滤液至50 mL 量瓶中，流动相定容至刻度，即得。

2.1.3 线性关系考察 精密称取对照品24.40 mg，置于100 mL 量瓶中，乙腈超声溶解后稀释定容，得244 μg／mL 贮备液，流动相依次稀释至12.2、6.1、2.03、0.61、0.061、0.030 5 μg／mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝64.847 1X+30.816 2 （r＝0.999 8），在0.030 5～12.2 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.4 方法学考察 取“2.1.2” 项下供试品溶液适量，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得隐丹参酮含量RSD 为0.44%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。取0.030 5、2.03、12.2 μg／mL 对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得隐丹参酮含量RSD 分别为0.82%、0.57%、0.20%，表明仪器精密度良好。取同一批滴丸，按“2.1.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得隐丹参酮含量RSD 为1.49%，表明该方法重复性良好。精密称取9 份滴丸粉末，每份约20 mg，置于三角瓶中，分为高、中、低3 组，分别加入贮备液15、10、15 mL，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得隐丹参酮平均加样回收率分别为100.26%、101.12%、99.81%，RSD分别为0.59%、0.73%、0.92%。

2.2 滴丸制备及质量评价 参考文献 ［15］报道。

2.2.1 制备过程 采用熔融法，称取原料药粉末（过100 目筛）、基质适量，置于滴丸试验机中，在75 ℃下加热熔融，搅拌（转速200 r／min） 30 min 至熔融液完全溶解澄清，冷凝液选择二甲基硅油，调节其滴距后以一定滴速滴制（滴口内径2.5 mm，外径4.0 mm），收集，搽拭干净，即得。每组均滴制300 丸。

2.2.2 评价方法 挑选外观圆整光滑的滴丸，计算成型率，公式为成型率＝（外观圆整光滑滴丸数／总滴丸数） ×100%。取滴丸20 粒，精密称定质量，计算平均丸重W平均，再依次称定每个滴丸质量Wi，计算质量差异，公式为质量差异＝［（Wi-W平均）／W平均］ ×100%。

2.3 处方工艺优化 采用单因素试验。

2.3.1 PEG 4000 与PEG 6000 比例 PEG 4000、PEG 6000 均是滴丸制剂常用基质［16］，课题组前期发现采用前者制得的熔融液黏度较低，液滴大小不均匀，滴速较快，难以控制；后者制得的熔融液黏度较高，滴速较慢，即单用两者均会影响滴丸成型率、质量差异［16］，故本实验选择其混合物作为基质。固定基质与隐丹参酮比例6 ∶1，冷凝温度12 ℃，滴速35 滴／min，滴距7 cm，测定成型率、质量差异，结果见图1。由此可知，PEG 4000 与PEG 6000 比例为1 ∶1 时成型率较高，质量差异较小，可能是由于在该比例下基质熔点、熔融液黏度适中，滴速易于控制，熔融液滴大小均匀。

图1 PEG 4000 与PEG 6000 比例对成型率、质量差异的影响（n＝3）Fig．1 Effects of PEG 4000-PEG 6000 ratio on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.2 基质与药物比例 固定PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，冷凝温度12 ℃，滴速35 滴／min，滴距7 cm，测定成型率、质量差异，结果见图2。由此可知，随着基质用量增加，成型率先升高后趋稳，而质量差异先降低后趋稳，可能是由于两者比例影响了熔融液黏度所致；为7 ∶1、8 ∶1 时成型率较高，质量差异较小，为了减少辅料用量，提高制剂载药量，最终选择7 ∶1。另外，隐丹参酮在PEG 4000 与PEG 6000 比例为1 ∶1 熔融液中的溶解度为0.35 g／g，表明基质与药物比例为7 ∶1 时后者可完全溶于前者中。

图2 基质与药物比例对成型率、质量差异的影响（n＝3）Fig．2 Effects of matrix-drug ratio on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.3 冷凝温度 固定PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，基质与药物比例7 ∶1，滴速35 滴／min，滴距7 cm，测定成型率、质量差异，结果见图3。由此可知，冷凝温度过低时滴丸冷凝较快，易出现拖尾现象，导致成型率较低，质量差异较大；冷凝温度过高时滴丸冷凝较慢，下沉至滴丸机底部后撞击使其变形，导致成型率降低，但进一步升温对滴丸质量影响不大，最终选择12 ℃。

图3 冷凝温度对成型率、质量差异的影响（n＝3）Fig．3 Effects of condensate temperature on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.4 滴速 固定PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，基质与药物比例7 ∶1，冷凝温度12 ℃，滴距7 cm，测定成型率、质量差异，结果见图4。由此可知，滴速过慢，熔融态液滴变大，质量差异较大；滴速过快，滴丸容易粘连［17］，成型率较低，质量差异也较大；为30、35 滴／min 时成型率均大于90%，质量差异均小于10%，考虑到制备效率，最终选择35 滴／min。

图4 滴速对成型率、质量差异的影响（n＝3）Fig．4 Effects of dropping speed on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.5 滴距 固定PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，基质与药物比例7 ∶1，冷凝温度12 ℃，滴速35 滴／min，测定成型率、质量差异，结果见图5。由此可知，滴距过小时熔融态液滴进入冷凝液的时间较短，未完全收缩成规则球形，导致成型率较低；滴距过大时熔融态液滴撞击冷凝液面后易导致形变，进而影响成型率；为7 cm 时成型率、质量差异均较理想。

图5 滴距对成型率、质量差异的影响（n＝3）Fig．5 Effects of dropping distance on forming rate and weight difference （n＝3）

2.4 验证试验 根据“2.3” 项下结果，确定最优处方工艺为PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，基质与药物比例7 ∶1，滴速35 滴／min，冷凝温度12 ℃，滴距7 cm。按上述优化工艺平行制备3 批样品，进行验证试验，测得平均成型率为（94.86±1.18）%，质量差异为（8.89±0.72）%，表明该工艺重复性良好。

2.5 溶散时限检查 取6 粒滴丸，设定筛网孔径为2.0 mm （20 粒滴丸平均直径为3.98 mm），采用加挡板法测得平均溶散时限为（7.1±0.2） min。

2.6 溶解度测定 取过量原料药、物理混合物（原料药+空白基质，比例同滴丸）、滴丸至蒸馏水中，25 ℃水浴中磁力搅拌（800 r／min） 2 d，取上层混悬液，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。结果，三者溶解度分别为 （0.96±0.05）、（1.07±0.06）、（38.93±2.96） μg／mL，即滴丸可将原料药溶解度提高至40.55 倍。

2.7 扫描电镜分析 取原料药、空白基质（PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，仅简单混合）、物理混合物（原料药+空白基质，比例同滴丸，研细）、滴丸粉末适量，喷金60 s 后在扫描电镜上观察形态，结果见图6。由此可知，原料药呈长方体晶体形态（图6A），空白基质呈片状形态（图6B），物理混合物中原料药、空白基质仅是简单混合（图6C），滴丸中未发现原料药长方体晶体形态（图6D），表明原料药在滴丸中的存在形式发生了改变。

图6 各样品扫描电镜图Fig．6 Scanning electron microscope images of various samples

2.8 晶型分析 设定扫描速度为6°／min，扫描范围（2θ） 为3°～45°，Cu-Kα 靶。取原料药、空白基质（PEG 4000 与PEG 6000 比例1 ∶1，仅简单混合）、物理混合物（原料药+空白基质，比例同滴丸）、滴丸粉末适量，置于玻璃槽后进行X 射线粉末衍射扫描，结果见图7。由此可知，原料药在7.5°、8.8°、12.6°、25.3°等处出现特征晶型峰；物理混合物图谱中上述特征晶型峰仍可见，但强度下降，表明原料药晶型状态未改变；滴丸图谱中上述特征晶型峰均消失，仅发现空白基质特征衍射峰，表明原料药转变为无定形状态。

图7 各样品X 射线粉末衍射图Fig．7 X-ray powder diffraction patterns for various samples

2.9 体外溶出度研究 前期发现，隐丹参酮在1.5%SDS 溶液中的溶解度为8.74 μg／mL。取原料药、物理混合物（比例同滴丸）、滴丸适量（均含2 mg 隐丹参酮），置于转篮中，设定溶出介质为900 mL 0.5%SDS 溶液，溶出仪介质温度、转篮转速分别为（37±1）℃、100 r／min，于10、15、30、45、60、90、120、180 min 各取样3 mL，并补充空白介质5 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图8。由此可知，原料药、物理混合物180 min 内累积溶出度分别为27.46%、29.11%，表明基质对原料药具有一定促溶作用，但效果不明显，而滴丸45 min内累积溶出度即达94.74%。

图8 隐丹参酮体外释药曲线（n＝6）Fig．8 In vitro drug release curves for cryptotanshinone （n＝6）

2.10 稳定性考察 取滴丸适量，密封后置于温度40 ℃、相对湿度75% 的恒温恒湿箱中，于0、1、2、3、6 个月后取出，测定水分、质量差异、溶散时限。结果见表1。由此可知，滴丸在加速条件下放置6 个月后外观、水分、重量差异、溶散时限仍符合2020 年版《中国药典》 丸剂项下要求。

表1 稳定性考察结果（n＝3）Tab．1 Results of stability investigation （n＝3）

2.11 体内药动学研究

2.11.1 分组、给药与采血 18 只家兔随机分为隐丹参酮组、物理混合物组（药物与基质比例同滴丸）、隐丹参酮滴丸组，禁食过夜，将原料药、物理混合物分散于0.5%CMC-Na 溶液中进行灌胃给药，滴丸使用温水送服，剂量均为40 mg／kg（以隐丹参酮计），乙醚麻醉后隐丹参酮组、物理混合物组家兔于0、0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8 h 采血，隐丹参酮滴丸组家兔增加12 h 采血点，采血量均约为0.5 mL，引流至肝素浸润离心管中，涡旋5 s，4 000 r／min 离心3 min，取上层血浆密封，在-20 ℃下冷冻保存。

2.11.2 血浆样品处理 参考文献［18］ 报道，精密吸取100 μL 血浆样品，加入内标溶液（取非诺贝特对照品适量，甲醇制成质量浓度为500 ng／mL，即得） 50 μL、乙腈1 mL，涡旋30 s，12 000 r／min 离心10 min，取上层有机相，45 ℃氮气吹干得残渣，100 μL 乙腈复溶。

2.11.3 线性关系考察 取1 000 ng／mL 对照品溶液适量，甲醇依次稀释至500、250、100、50、25 ng／mL，精密取0.5 mL，45 ℃氮气吹干，加入0.5 mL 空白血浆，涡旋30 s 后按“2.11.2” 项下方法处理，即得血浆对照品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），隐丹参酮、内标峰面积比值为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝0.002 3X+0.082 7 （r＝0.995 6），在25～1 000 ng／mL 范围内线性关系良好。

2.11.4 方法学考察 取25、500、1 000 ng／mL血浆对照品溶液适量，同一天内在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得隐丹参酮峰面积RSD分别为4.12%、3.05%、3.22%，表明该方法日内精密度良好；同法连续测定6 d，每天1 次，测得隐丹参酮峰面积RSD 分别为7.62%、5.47%、4.98% （n＝6），表明该方法日间精密度良好。取给药8 h 后血浆样品适量，室温（温度25 ℃，相对湿度55%） 下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得隐丹参酮、内标峰面积比值RSD 为8.48% （n＝6），表明样品在24 h 内稳定性良好。空白血浆配制隐丹参酮质量浓度分别为25、250、1 000 ng／mL 的血浆样品，按“2.11.2” 项下方法处理，在“2.1.1” 项色谱条件下各进样测定3 次，测得隐丹参酮平均加样回收率分别为90.10%、95.72%、94.22%，RSD 分别为3.84%、7.15%、5.29%。

2.11.5 结果分析 血药浓度-时间曲线见图9，再采用3P97 程序统计矩模型计算主要药动学参数，结果见表2。由此可知，与原料药比较，物理混合物tmax、t1／2、Cmax、AUC0～t无明显变化（P＞0.05），表明基质对隐丹参酮药动学基本无影响，促吸收作用有限；与原料药、物理混合物比较，滴丸tmax缩短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相对生物利用度与原料药相比增加至2.70 倍。

表2 隐丹参酮主要药动学参数（±s，n＝6）Tab．2 Main pharmacokinetic parameters for cryptotanshinone （±s，n＝6）

表2 隐丹参酮主要药动学参数（±s，n＝6）Tab．2 Main pharmacokinetic parameters for cryptotanshinone （±s，n＝6）

注：与隐丹参酮比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与物理混合物比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

参数单位隐丹参酮物理混合物隐丹参酮滴丸tmaxh1.03±0.260.94±0.230.52±0.14*＃t1／2h2.89±0.683.07±0.632.92±0.72 Cmaxng·mL-1368.79±92.04402.65±107.62808.36±186.10**＃＃AUC0 ～tng·mL-1·h1 033.18±162.431 098.04±177.462 794.44±238.73**＃＃AUC0～∞ng·mL-1·h1 076.45±171.061 127.79±184.602 903.65±255.67**＃＃

图9 隐丹参酮血药浓度-时间曲线（n＝6）Fig．9 Plasma concentration-time curves for cryptotanshinone （n＝6）

3 讨论

固体分散体易吸潮［19］，可能会影响药物稳定性及药效，故需经压片、填充胶囊等过程才能供临床使用。纳米混悬剂［12］、固体脂质纳米粒［11］等纳米制剂对设备要求较高，固化成粉末时需大量冻干保护剂，导致制剂载药量较低，并且在储存过程中或口服进入胃肠道后会发生粒径增长情况［20-21］，可能导致促吸收作用减弱。滴丸工艺简便，质量易控，适合目前我国中药企业实际生产水平，故本实验将隐丹参酮制成滴丸，以期为临床提供一种可靠实用、价格低廉、安全有效的口服制剂。

晶型分析、扫描电镜结果表明，隐丹参酮以无定形状态存在于滴丸中，有利于溶解度、溶出速率、溶出度的提高；滴丸45 min 内累积溶出度达94.74%，可为改善药物吸收奠定基础。体内药动学研究结果表明，滴丸tmax缩短，可能与药物溶出速率较快有关；Cmax增加至2.19 倍，可能是由于隐丹参酮累积溶出度升高所致；相对生物利用度提高至2.70 倍，可能是因为滴丸提高了隐丹参酮溶解度、溶出速率、溶出度，解决了其吸收瓶颈［22］，并且原料药在滴丸中以无定形状态存在，往往具有更高的生物利用度［15，23］。今后，需对隐丹参酮滴丸不良反应、药效等方面进行评价，以期为该制剂提供更完整的研究资料。