虾肝肠胞虫研究进展

江海仪，李婉莹，高焕，2，3*

（1.江苏海洋大学，江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005；2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005；3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

肝胰腺微孢子虫病（hepatopancreatic microsporidiosis, HPM），由虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）侵染虾类的肝胰腺引起[1]。2004 年最早在泰国斑节对虾（Penaeus monodon）的肝胰腺中[1]发现EHP，2009 年经组织学、超微结构和系统发育数据分析，被成功分离并命名为EHP。多种重要经济养殖虾类会被EHP 侵染，如凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、日本对虾（Penaeus japonicus）、脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）等[2]，感染后的个体生长速度迟缓[1]。尽管在早期研究中观察到EHP流行率和感染程度较低[1]，但EHP 引起的HPM，仍在一些亚洲国家（包括泰国、印度、越南、马来西亚、印度尼西亚和中国等）虾类养殖业中蔓延，造成较大的经济损失[2]。在对虾的研究中还发现另一种微孢子虫——对虾八叠胞虫（Agmasoma penaei），它主要感染机体的结缔组织和肌肉，会导致虾的肌肉呈乳白色，肌肉纤维退化[1-8]。而严重感染EHP 的脊尾白虾肌肉也会发白，但是主要被侵染组织为肝胰腺和肠道，主要临床表现为生长速度缓慢，可以正常摄食，通常出现软壳、嗜睡、摄食量减少和中肠空虚等现象[9-10]。严重感染EHP 的虾类，肝胰腺出现萎缩，可能会因感染其他细菌或病毒导致死亡[11-12]。有研究表明，感染EHP 的虾，感染急性肝胰腺坏死病（AHPND）和脓毒性肝胰腺坏死（SHPN）的概率上升[13]。被感染虾的肝小管上皮细胞脱落明显，在管腔中观察到大量的孢子聚集[1]，肠道菌群结构被破坏[14]，虾肠道微生物区系、细菌介导功能、消化和免疫活动发生改变，虾的生长机能受到抑制[15]。由于EHP 具有由几丁质和蛋白质构成的胞壁，目前各种治疗手段效果均欠佳，主要侧重研究预防方法[1]。

1 EHP 生物学特性

EHP 归类于真菌界、微孢子虫门[16]，与分支在真菌界的隐真菌门是姊妹门[17]。EHP 基本结构包括高电子密度外壁、低电子密度内壁、原生质膜组成的胞壁、锚定盘[16]、胞原质、细胞核[16]、极膜层以及特殊的侵染装置——极管等[16]。成熟EHP 孢子在光学显微镜镜下呈直径为（0.7±1.1）μm 的椭圆形[16]，孢子顶端的锚定盘与极管相连接[7]。EHP 孢子在细胞膜周围有一层厚厚的保护性几丁质壁，使它们能够在宿主外存活并参与微孢子虫的发病机制[18]。

EHP 生活史可划分为3 个阶段，包括宿主体外的感染期、宿主细胞内的裂增殖期和孢子增殖期，与之对应的是孢子、母孢子与孢子母细胞[3]。因为成熟的EHP 孢子是EHP 在宿主细胞外的载体[16]，所以在宿主体外成熟孢子通过弹出极管，释放孢原质，让孢原质（孢子）通过被刺穿的细胞质膜进入宿主细胞内[3]。在宿主细胞入侵过程中，环境刺激让孢子萌发，通过外翻释放极管，孢原质通过极管转移到宿主细胞的细胞质中，孢原在此发育并完成生命周期[19]。Aldama-Cano 等[20]利用Phloxin B 染色，发现可通过挤压其极管来测量纯化的EHP 孢子的活性。Jaroenlak 等[21]鉴定了EHP 的第一个孢壁蛋白（EhSWP1），发现EhSWP1 定位于孢子内壁和外壁，能够利用其N 端的3 个肝素结合基序（HBMs），在感染过程中参与了孢子与宿主细胞表面肝素（一种氨基葡聚糖）的连接。裂增殖期是一个非传染性阶段，孢原质进入宿主细胞后与细胞质直接接触，孢子通过截取宿主营养物质进行核分裂，发育成熟后成为裂殖体并发生变异，当变异的母孢子积累到一定程度，便进入孢子增殖期[3]。这一时期代表了EHP的增殖期，在宿主细胞中有多核的细胞质，含有许多细胞核[16]。孢子增殖期是宿主细胞的多细胞阶段，该时期宿主的肝胰腺被感染，肝小管上皮细胞破裂[1]，释放的成熟孢子可以感染自身其他肝小管细胞或通过粪便进入水体环境中感染其他虾[1]。

2 流行与传播途径

EHP 于2013 年在我国被检出，其引发的对虾HPM 在我国主要对虾养殖区流行。如2015 年浙江省接近四分之一（23.1%）的凡纳滨对虾虾苗携带EHP[22]；同年辽宁省三分之一以上（34.6%）的凡纳滨对虾病虾中都能检测到EHP[23]；2015—2016 年江苏如东地区因养殖对虾感染EHP，生长受影响，导致产量下降15%～30%[24]。除了在我国众多省市被检出，EHP 在泰国、越南、印度等国家亦被发现。在泰国，由EHP 引起的对虾肝胰腺微孢子虫病与对虾白斑综合征、急性肝胰腺坏死病，共同成为对虾养殖产业的重大问题，对养殖区造成了巨大影响[25]。

EHP 可以通过摄食被EHP 污染的饲料、饵料、病虾残体以含有成熟孢子的养殖水体进行水平传播，也可以由母代宿主传递给子代宿主进行垂直传播[12]。Salachan 等[26]将感染EHP 的对虾和健康虾混合养殖，导致EHP 侵染健康虾；而Pattarayingsakul 等[27]通过对养殖感染EHP 对虾的水体进行孢子活性检测，并用养殖过病虾的水体养殖健康凡纳滨对虾，证明EHP 可以进行水平传播。在其他的微孢子虫研究中，会用其存在于宿主的性腺组织，证明这些微孢子虫可垂直传播[28]。但原位杂交（ISH）试验检测感染EHP 的幼虾和亲虾的性腺、肝胰腺组织，发现性腺组织中没有EHP 阳性信号[29]，而肝胰腺中出现阳性信号[29]。该研究没有检测各个生命阶段的虾，且取样数量有限，并不能证明EHP 无法实现垂直传播[30]。文献[30]研究发现，被投喂病虾组织的凡纳滨对虾亲虾，其孵化池中的无节幼体会被EHP 侵染，这可能是通过水平传播给孵化场中的后代，因为处于N6 阶段的无节幼体，以浮游生物为食，此时会受到侵染[29]。程东远[31]对中国4 个不同地区的凡纳滨对虾群体进行对虾生长参数测量，并检测各群体对虾的肝胰腺组织中的EHP 感染载量，发现群体样本数和EHP 对数因地区不同而存在差异，认为EHP 的传播方式因群体而异。

3 病理症状

虾肝肠胞虫不会在虾体外部造成可见的迹象，但它确实减缓了其生长速度[16]。饲料系数的下降也是感染EHP 对虾的临床症状[32]。此外，感染EHP 的对虾容易受到继发性细菌和病毒感染[33]。自2003 年以来，在泰国养殖的斑节对虾中发现了EHP，感染的对虾表现为生长缓慢综合征（MSGS），并与斑节杆菌病毒（MBV）、肝胰腺细小病毒（HPV）和弧菌等条件病原体混合感染[34]。脓毒性肝胰腺坏死（SHPN）和EHP病例之间的密切关联表明，EHP 增加了虾对弧菌的易感性[35]，因为EHP 感染会破坏肝胰管细胞，使弧菌可以定殖在脱落的细胞和暴露的基底膜。

文献[1，36-37]研究发现，染病虾肝胰腺组织中有EHP 孢囊和被染成妃红色的孢子，同时肝小管上皮细胞会出现不同生命阶段的EHP，感染严重的上皮细胞会裂解或脱落。利用被EHP 感染虾的肝胰腺组织制作湿涂片，通过Phloxin B 染色可观察到EHP 孢子[20]。感染EHP 的虾肝胰腺会萎缩，肠道产生炎症[25，38]，个别病虾可排白便[1]。但对凡纳滨对虾的研究发现，白便综合征（WFS）与EHP 没有因果关联[6]，因为曾经产生白色粪便的凡纳滨对虾池塘，即使停止产生白色粪便，池塘仍然可以检测出EHP[39]。肝胰腺和肠道是虾类重要的营养吸收和免疫器官，而肠道的结构和稳定性与宿主健康密切相关[39]。EHP 作为专性细胞内寄生虫，高度依赖宿主，利用宿主细胞质中丰富的环境和扩展的转运蛋白库，从而危害宿主的营养和代谢途径[40]。此外，感染EHP 的病虾相较于健康虾，血淋巴中白蛋量、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等指标均显著上升[41]，同时EHP 感染，会改变虾类的肠道菌群结构，从而破坏抵御病原体入侵的重要生物屏障，影响虾的营养代谢和免疫功能[15]。

4 检测方法

感染EHP 的虾症状并不明显，可以通过组织学、分子生物学等方法进行检测[12]。因为传统的组织切片制作时间较长且流程复杂，当病虾体内孢子含量较少时并不易被发现，不利于判断养殖虾类是否感染EHP。目前实验室检测EHP，多基于分子生物学方法，如巢式PCR、原位杂交、qRT-PCR 等，此类方法快速，灵敏度高，但对仪器设备和专业技术要求较高。如李英瑕等[42]利用环介导等温扩增（LAMP）技术研发的EHP 检测试剂盒，具有较高的诊断特异性和灵敏性、操作简单、便于运输等优势，适用于养殖场对EHP 进行检测。近来，有研究基于碘化丙啶可穿透微孢子虫活细胞膜的特性和孢子具有高度折光性的特点，利用荧光增白剂染色法及与碘化丙啶共染的双色荧光法，可快速检测虾肝肠胞虫。该方法操作简便，可在10 min 内完成初步检测，有利于养殖生产一线对EHP 感染的检测[20]。

5 防治措施

EHP 因其具有由几丁质和蛋白质组成厚厚的胞壁，且营胞内寄生，目前暂无针对性药物[7]。然而，在养殖各个环节均有可能发生EHP 感染，需要对每个可能的环节做好防范，降低感染的风险。有研究发现[43]，孢子在-20 ℃冷冻＞2 h 或分别浸泡在15 mg/L KMnO4、40 mg/L 65%活性氯或20%乙醇中15 min，其中的极丝释放受抑制，无法形成芽体，从而失去增殖能力。基于该发现，商用饲料或饵料可以在投喂前进行冷冻处理，同时可以利用高锰酸钾、活性氯或乙醇，对池塘进行处理。若池塘曾感染EHP，可在放苗前翻耕底泥，池底使用生石灰、高锰酸钾等物质消毒，亦可破坏其生存环境，降低虾类被感染的风险[44]。Pattarayingsakul 等[27]研究发现，在养殖水体中，虾肝肠胞虫孢子会因10 d 不充氧而失活，或用体积分数为20×10-6的次氯酸钙（浓度90%）处理24 h，迅速灭活。为预防EHP 传播，在进行亲虾的繁育前，应对苗种进行检测，以防传播，也应对池塘进行相应处理。日常的养殖管理需要及时清理病死虾、虾代谢废物和粪便，严格把控养殖水体的水质、来源，以防水体感染；可在饲料中添加可以保护肝胰腺、肠道的物品，提升虾免疫力。

6 结语

EHP 严重影响全球对虾养殖的经济效益，是实现健康养殖必须解决的重要问题之一。目前关于虾肝肠胞虫仍存在较多未研究清楚的问题，如EHP 的入侵机理、特效药的研究开发等。因此，接下来关于虾肝肠胞虫的防治工作可以围绕这几方面开展，同时还可以继续筛选具有抗EHP 的优良养殖品种。