运动预干预对心肌缺血/再灌注大鼠心肌氧化应激及线粒体融合和分裂的影响

刘俊蓉,周琛婓,王晓鹏,刘 珂,唐 丽,苏晓云,崔建梅

长期以来,缺血性心脏病一直是世界范围内高发病率和高死亡率的主要病因。在过去的几十年里,由于及时的再灌注医疗策略,如,经皮冠状动脉介入和冠状动脉搭桥等手段的干预,使得死亡率明显下降[1]。然而,再灌注往往会加重缺血心肌的结构和功能损伤,产生心律失常、收缩功能障碍和心肌细胞死亡等一系列负面后果和影响,最终导致心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤,而心肌I/R损伤又是急性心肌梗死临床治疗后的严重并发症之一[2],会给家庭和社会带来日益沉重的经济负担。因此,制定预防心肌I/R损伤的策略日益受到医生和保健专业人员的重视。

根据以往的研究结果,心肌I/R后由线粒体产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)导致的线粒体结构改变和功能障碍被认为是I/R诱导心肌损伤的关键驱动因素[3]。线粒体是一种动态的细胞器,是心肌细胞的主要能量来源,通过不断的融合和分裂改变其形态,形成新的线粒体,并有效去除受损或功能失调的线粒体。因此,线粒体分裂和融合的动态平衡对于维持线粒体的正常结构和功能至关重要[4]。大量研究表明,I/R会破坏线粒体融合和分裂的平衡状态,导致线粒体形态学的改变,进而引起线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡[5]。动态相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)是一种细胞质蛋白,Drp1在介导裂变中起核心作用,通过与裂变蛋白1等的结合来启动分裂,导致线粒体分裂和功能障碍,并与线粒体过度裂变导致的线粒体动态过程损伤与心肌细胞凋亡相关[6]。除线粒体裂变外,线粒体融合在心脏I/R损伤中也起着关键作用。视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)位于线粒体膜内,主要调节线粒体内膜的融合,OPA1的破坏会导致线粒体分裂、碎裂,甚至细胞死亡[7]。最近,Zhang等[8]报道的Drp1的失活和Mfn2的激活有助于改善线粒体功能障碍,延缓I/R的发生。Xue等[9]的研究发现,心脏线粒体功能障碍已被证实有助于线粒体ROS的产生,抑制线粒体分裂,增加融合可减少I/R化损伤并改善心脏功能。上述研究证实,OPA1、Drp1介导的心肌ROS增加可能在I/R诱导的心脏功能障碍方面起到重要作用。

众所周知,运动是一种非药物干预手段,以运动为基础的心脏康复可持续改善心梗患者的生活质量,减少住院和心源性死亡,并改善与健康相关的生活质量[10]。动物实验证实,运动预干预可以通过调控副交感神经活性来削弱I/R大鼠心肌氧化应激水平,保护线粒体的呼吸功能,降低心肌梗死的面积[11]。Marques-Aleixo等[12]的研究也发现,体育锻炼可以调节与线粒体融合和分裂相关的基因和蛋白的含量。Jiang等[13]的研究发现,8周有氧间歇运动预干预可以通过调节线粒体动力学信号传导相关蛋白Drp1的表达来改善线粒体的网络重构,认为此运动可以通过调节线粒体动力学和功能对大鼠心肌I/R损伤起到保护作用。此外,Zhang等[14]的研究发现,运动训练可以通过增加线粒体融合相关蛋白(OPA1)来降低脑缺血大鼠心肌梗死的面积。基于上述研究可知,运动训练可以对线粒体动力学产生有利影响,可以推测运动预干预可能通过保护线粒体的功能或维持其动态平衡来减轻I/R大鼠的心肌损伤。因此,本研究通过观察8周有氧运动预干预对I/R大鼠心肌纤维结构、心脏功能及心肌氧化应激水平和Drp1及OPA1表达的影响,探讨运动预干预对I/R大鼠心肌保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.2 试剂及仪器

SOD(超氧化物歧化酶)及MDA(丙二醛)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;Drp1及OPA1抗体购自美国ABclonal公司;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;ALC-V8型动物呼吸机购自上海奥尔特生物科技有限公司;光学显微镜购自日本 Olympus 公司;JD-801型形态学图像分析软件购自江苏省捷达科技发展有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 运动方案

1.3.2 心肌I/R模型建立

1.3.3 左心室功能测定

用BL-420S生物机能实验系统监测大鼠的心功能,分别记录左冠状动脉前降支结扎前(T0)、结扎后30 min(T1)及再灌注120 min(T2)心功能指标。指标包括:左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP,mmHg)、左室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure,LVDEP,mmHg)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.3.4 心肌组织SOD活性及MDA水平的测定

1.3.5 HE染色

1.3.6 Western blot法检测心肌组织Drp1及OPA1蛋白表达

1.4 数据处理与分析

采用 SPSS19.0 统计软件进行数据处理,数据结果用平均数±标准差(mean±SD)表示,组间比较采用单因素方差分析(One Way Anova),以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果与分析

2.1 跑台运动预干预对I/R大鼠左心室功能的影响

如表1所示,各组大鼠的心脏功能指标在心肌缺血前无明显差异性(P>0.05)。与sham组比较,I/R组在心肌缺血30 min与再灌期120 min后,左室收缩压(P<0.01)及左室内压最大上升速率(P<0.01)和下降速率(P<0.01)均显著降低,左室舒张末期压力(P<0.01)显著增加;I/R+EX组除大鼠再灌期(120 min)左室舒张末期压力与sham组比较无显著差异外(P>0.05),大鼠心肌缺血30 min及再灌期120 min后的左室收缩压(30min:P<0.01;120 min:P<0.05)及左室内压最大上升速率(P<0.01)和下降速率(30 min:P<0.01;120 min:P<0.05)均显著降低,心肌缺血30 min的左室舒张末期压力(P<0.01)显著增加。与I/R组比较,I/R+EX组左室收缩压(P<0.05)及左室内压最大上升速率(P<0.01)和下降速率(30 min:P<0.01;120 min:P<0.05)均显著增加,左室舒张末期压力(P<0.05)显著下降。而sham组与EX组比较,除EX组左室收缩压(再灌期120 min)显著增加外,两组之间缺血前、心肌缺血30 min与再灌期120 min后的心脏功能指标均无显著差异(P>0.05)。表明,运动预干预可在一定程度上改善I/R引起的心脏舒缩功能障碍,进而改善心脏功能。

表1 各组大鼠心脏功能结果表

2.2 跑台运动预干预对 I/R 大鼠心肌组织病理变化的影响

由图2可见,sham组与EX组心肌纤维呈线状排列,染色均匀,细胞形态正常,结构及核膜完整,且区分明显;I/R组心肌纤维排列紊乱且有断裂,心肌细胞水肿明显,部分心肌细胞呈现核固缩;I/R+EX组心肌病理性变化程度(心肌细胞水肿及炎性细胞浸润程度)均较I/R组减轻,心肌纤维排列稍整齐,心肌受损的程度也进一步下降,心肌损伤程度介于sham组和I/R组之间。

图2 各组大鼠左心室心肌组织HE染色结果图(×100)Figure 2 HE staining results of myocardial tissue of left ventricle in each group rats(×100)

2.3 跑台运动预干预对I/R大鼠心肌组织SOD活性及MDA水平的影响

如图3所示,与sham组比较,I/R组和I/R+EX组心肌组织SOD活性(I/R:P<0.01,I/R+EX:P<0.05)均显著下降,MDA水平(I/R:P<0.01,I/R+EX:P<0.05)均显著增加;与I/R组比较,I/R+EX组心肌组织SOD活性(P<0.05)显著增加,MDA水平(P<0.01)显著下降;而EX组与sham组比较,心肌组织SOD活性(P<0.05)显著增加,MDA水平在两组之间无显著差异(P>0.05)。

图3 各组大鼠心肌组织SOD活性及MDA水平结果图Figure 3 Results of SOD activity and MDA level in myocardial tissue in each group rats注:##P<0.01,#P<0.05,与sham组比较;**P<0.01,*P<0.05,I/R+EX组与I/R组比较。

2.4 跑台运动预干预对I/R大鼠心肌组织Drp1及OPA1蛋白表达的影响

图4 各组大鼠心肌组织 Drp1及OPA1相对蛋白表达条带图Figure 4 Bands of relative protein expression of Drp1 and OPA1 in myocardial tissue of rats in each group注:##P<0.01,#P<0.05,与sham组比较;**P<0.01,*P<0.05,I/R+EX组与I/R组比较。

3 讨 论

3.1 跑台运动预干预对I/R大鼠心肌组织及心脏功能的影响

3.2 跑台运动预干预对I/R大鼠心肌组织氧化应激的影响

氧化应激是指自由基产生而导致的体内氧化和抗氧化作用的失衡状态,对细胞代谢产生多种负面影响。活性氧生成增加或抗氧化防御减少导致的氧化应激与心血管疾病的病理生理学有关[26]。线粒体是细胞产生ROS 的重要场所,正常情况下,由于抗氧化酶的抑制作用,ROS处于较低水平,而在I/R期间,由于钙超载等导致氧自由基的迅速堆积,内源性抗氧化系统被破坏,自由基不能被清除,被认为是I/R导致心肌组织损害的重要原因之一[27]。有研究表明,心肌缺血可降低心肌抗氧化酶SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,并且大量的ROS可诱导脂质过氧化反应,在不饱和脂肪酸的作用下产生过量的MDA,最终通过多种途径造成心肌细胞结构破坏,引发I/R心肌损伤[28]。Yin等[29]通过临床研究发现,急性心梗合并心律失常与患者血清SOD活性下降、MDA含量增加有关。并且动物实验证实,I/R后心脏舒缩功能下降与I/R降低了心肌抗氧化酶SOD、GSH-Px活性及CAT水平有关,认为心肌I/R对大鼠心脏功能的影响可能是通过氧化应激途径介导的[30]。本研究结果显示,心肌I/R减弱了大鼠心肌组织抗氧化的防御机制,具体表现为I/R大鼠心肌组织SOD活性下降,MDA水平增加,以上心肌组织抗氧化能力下降或许与I/R大鼠心脏功能下降有关。有研究表明,规律性体育锻炼被认为是预防和治疗心血管疾病和I/R损伤的重要干预方式[31]。近来的研究发现,运动预干预可以使机体对活性氧损伤产生良好的适应能力,通过氧气的有效供给和能量的有效利用,减少因氧化系统过度负荷和组织相对缺血缺氧所导致的自由基生成[32]。路富林等[33]的研究发现,6周中等强度跑台运动预干预对I/R心肌损伤具有保护作用,这种保护作用可能与此运动增加心肌线粒体SOD活性、降低MDA含量从而降低心肌氧化应激损伤有关。本研究对I/R大鼠进行8周跑台运动预干预,发现运动预干预使I/R大鼠的心肌抗氧化活性酶SOD活性有一定恢复,使MDA水平下降。本研究还发现,运动预干预使I/R大鼠心肌受损的程度下降、心脏功能改善,因此,可以认为运动预干预可能通过增强心肌组织抗氧化能力改善I/R大鼠心肌受损程度和心脏功能。

3.3 跑台运动预干预对I/R大鼠心肌组织Drp1及OPA1表达的影响

大量研究表明,心肌I/R的重要标志之一是线粒体结构和功能的改变。线粒体在能量产生中起关键作用,其融合、分裂的动态平衡是保证心肌细胞正常能量代谢及心肌收缩力的重要决定因素,而I/R会破坏这种平衡,使线粒体分裂增加,并呈现片段化,有可能导致心肌梗死的发生,这与I/R诱导的心功能障碍有关[34],而抑制线粒体分裂相关蛋白的表达(如Drp1)已被证明在心肌缺血/再灌注期间发挥心脏保护作用,表现为减少心肌梗死面积和改善左心室功能障碍[35]。Ding等[36]的研究表明,在糖尿病条件下,Drp1介导的线粒体分裂在I/R线粒体功能下降及心脏功能障碍方面起重要作用。Sharp等[37]的研究发现,心脏骤停后,Drp1抑制剂可以改善自主血液循环发生的时间和心肌血流动力学,进而改善心脏骤停模型小鼠的生存和神经预后。有研究认为,线粒体融合在I/R中起着关键作用,促进线粒体融合可能在I/R期间提供心脏保护[38]。Khuanjing等[39]的研究发现,在心肌缺血和再灌注开始时,可以通过增加线粒体融合蛋白OPA1减轻线粒体功能障碍和动态失衡,从而减少梗死面积,改善心功能,发挥心脏保护作用。本研究结果显示,与sham组比较,I/R组大鼠心肌组织Drp1蛋白表达上调,OPA1蛋白表达下降,说明I/R后线粒体分裂增加,融合减少,从而导致I/R心肌损伤的形成。近年来,线粒体动态平衡被认为是治疗多种疾病,特别是治疗I/R损伤的有效靶点[40]。在I/R心肌损伤后,线粒体动力学平衡失调,而抑制过度的线粒体碎裂或增强线粒体融合可预防急性心脏缺血/再灌注损伤[41]。有研究认为,对于运动训练诱导的抗I/R损伤的心脏保护方面,有不同的细胞机制被提出,而线粒体在结构和功能上的适应性训练似乎在心脏保护中起着核心作用[42]。Zhao等[43]的研究表明,8周游泳运动预干预(15 min/d,5次/周)可以通过调节线粒体裂变、融合信号改善线粒体形态,抑制心肌梗死小鼠心肌纤维化和细胞凋亡,从而恢复心肌梗死后线粒体形态并改善心脏功能。另一项研究发现,高强度间歇训练预干预8周后,I/R大鼠心肌梗死面积减少,心肌组织融合蛋白表达增多、分裂蛋白Drp1表达减少,提示运动诱导的线粒体融合和分裂的调节可导致心肌线粒体动力学的改善,似乎参与了运动对I/R损伤的保护[44]。本研究结果表明,与I/R组大鼠比较,经过8周跑台运动预干预,I/R+EX大鼠心肌组织Drp1蛋白表达显著减少,OPA1蛋白表达显著增多。而Zhang等[14]研究发现,运动预干预(2周低强度跑台)对心肌线粒体Drp1蛋白表达无明显影响,但可明显提高OPA1蛋白表达。因此,针对不同研究得到的不同结果可能与不同研究选取的运动干预强度及时间不同有关。有研究认为,线粒体分裂增加、融合不足可以显著增加心肌梗死面积,这与I/R敏感性的增加有关[45]。因此,本实验中跑台运动预干预改善I/R大鼠心脏功能可能与此运动下调心肌分裂蛋白Drp1、上调融合蛋白OPA1表达有关。有研究表明,线粒体是ROS的主要来源和靶点,I/R引起线粒体融合/分裂的动态平衡改变,致使线粒体出现过度分裂,ROS生成增加,是刺激氧化应激反应的上游信号通路,而过多的ROS会加重线粒体分裂[19]。并且Ding 等[36]的研究发现,Drp1抑制剂可通过增强糖尿病I/R小鼠心脏MnSOD的活性,降低MDA的形成,提示抑制Drp1可有效降低I/R诱导的氧化应激。此外,Zhang等[8]的研究发现,抗心衰药物可以部分通过平衡心力衰竭小鼠的线粒体功能抑制线粒体ROS的生成,从而改善冠状动脉结扎诱导的心脏收缩功能及心脏结构损伤。因此可以推测,8周跑台运动预干预能够增强I/R大鼠心脏功能及削弱心肌组织损伤,可能与此运动维持线粒体动态平衡从而降低I/R诱导的心肌氧化应激有关,但是线粒体融合及分裂蛋白通过何种途径影响心肌氧化应激,还需要进一步研究证实。

4 结 论

8周中等强度跑台运动预干预可以通过维持线粒体分裂与融合的动态平衡,减轻I/R诱导的心肌氧化应激损伤,进而改善I/R大鼠左心室舒缩功能障碍及心肌组织损伤。维持线粒体分裂与融合的动态平衡应该是预防心肌缺血/再灌注损伤的一种潜在策略。