丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的制备及应用

俞林双,金万慧,周 颖,杨悦悦,雷彩虹,3,朱海霖,3,陈建勇

(1.浙江理工大学纺织科学与工程学院(国际丝绸学院),杭州 310018; 2.湖北省纤维检验局,武汉 430000;3.浙江省现代纺织技术创新中心,浙江绍兴 312000)

突发性创伤出血在日常生活中不可避免,大量的失血和伤口感染可能会危及生命,因此开发具有抗菌止血的创伤愈合材料具有重要意义。丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子蛋白,具有良好的生物相容性和可降解性,同时具有一定的止血能力和抗菌性能[1-2],在生物医用材料领域得到了很多研究与应用[3-4]。但单一的丝素蛋白材料止血、抗菌性能不足,限制了其在创面敷料中的应用[5]。因此,构建兼具抗菌、止血功能的丝素基敷料成为研究热点。抗菌剂一般有无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂三大种类。无机抗菌剂有Ag、Cu、ZnO等金属及金属化合物[6];有机抗菌剂有季铵盐、卤胺类等[7]。这两类抗菌剂虽应用广泛、抑菌效率高[8],但仍难以避免化学合成中造成的环境问题以及存在危害人体健康的弊端[9],这使得天然抗菌剂在医药材料领域成为了更好的选择[10]。茜草素是采用乙醇为溶剂从茜草的根中提取得到,是天然药用植物茜草的主要有效成分,属于蒽醌类化合物,具有止血、抑菌抗炎等作用[11-12],并且对人体副作用小,除了在现代医疗领域中有极其广泛的应用外,还被广泛用作天然食用色素和天然染发剂[13]。

静电纺丝是一种制备功能性纤维膜的高效方法[14],制备的纤维膜具有较好的生物相容性能和可调节的孔隙率,不仅有益于细胞呼吸增殖加速创面愈合,其较大的比表面积又能增加吸水量,能够有效地提高止血效率[15]。本文以茜草素为止血抗菌剂,以六氟异丙醇为溶剂制备一定质量比的丝素蛋白/茜草素纺丝溶液,再通过静电纺丝法制备复合纤维膜。分析不同质量比下所得丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的微观形貌、吸水率、止血性能和抗菌性能,探究茜草素含量对丝素蛋白纤维膜止血抗菌性能的影响。希望能制备出一种具有良好抗菌效果丝素基止血材料,为今后开展丝素基创面敷料的研究奠定基础。

1 实 验

1.1 实验材料和仪器

实验材料:蚕茧,浙江米赛丝绸有限公司;六氟异丙醇(99.5%),上海晶纯生化科技股份有限公司;茜草素,国药集团化学试剂有限公司;无水碳酸钙,无水氯化钙,无水乙醇,氯化钠,杭州高晶化工有限公司;磷酸盐缓冲液(pH=7.2～7.4),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;新西兰兔血,杭州赛洛进生物科技有限公司;营养琼脂,酵母浸粉,蛋白胨,杭州百思生物技术有限公司;金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC6538),大肠杆菌标准菌株(ATCC 11229),上海鲁微科技有限公司;灭菌级医用纱布敷料,南昌市奥康医疗器械有限公司;去离子水,实验室自制。

实验仪器:SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(杭州惠创仪器设备有限公司);真空冷冻干燥机FD-80(北京博医康实验仪器有限公司);凯特TG18G台式高速离心机(上海晚成医疗器械有限公司);HJ-4A磁力搅拌器(上海路晨科学仪器有限公司);JDF05型静电纺丝机(长沙纳仪仪器科技有限公司);GI54DWS高压灭菌锅(厦门致微仪器有限公司);DNP-9082电热恒温培养箱,恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司);SW-CJ-1D(实用型)单人单面垂直净化工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的制备

丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的制备步骤包括丝素蛋白的制备、纺丝液的制备和丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的制备,实验流程图如图1所示。

图1 实验流程Fig.1 Experimental procedure

1.2.1 丝素蛋白的制备

蚕茧在98 ℃的2%的碳酸钠溶液中脱胶,脱胶时间3 h。脱胶后用去离子水冲洗蚕丝至无粘腻感。将蚕丝60 ℃烘干,再按质量比1∶50的浴比在98 ℃的三元溶液CaCl2/CH3CH2OH/H2O(物质的量比 1∶2∶8)中溶解3 h,室温冷却后置于离心机中以1200 r/min的速度离心,15 min后取上清液抽滤后倒入透析袋中在去离子水中透析3 d,每隔12 h更换一次去离子水。-80 ℃冷冻干燥3 d,获得纯丝素蛋白。

1.2.2 纺丝液的制备

以六氟异丙醇为溶剂,配制成质量分数为12%的丝素蛋白溶液,再根据丝素蛋白/茜草素的质量比(60∶1、30∶1、15∶1、10∶1),加入相应质量的茜草素配制出不同质量比的丝素蛋白/茜草素混合纺丝液。

1.2.3 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的制备

将制得的纺丝液装入10 mL的一次性注射器内,安装上内径为18 G规格的不锈钢点胶针头的喷射口,固定在注射泵上,采用硅油纸收集复合纤维膜,以便更好分离复合纤维膜与接收辊。实验中,注射泵推进的速度为0.5 mL/h,针头到滚轴的距离为10 cm,电压箱设置参数15 kV,时间2 h。并对制得的纤维膜采用75%乙醇浸泡1 h,常温自然干燥后得到丝素蛋白/茜草素复合纤维膜。将纯丝素蛋白纤维膜样品记为SF,不同质量比丝素蛋白/茜草素复合纤维膜样品(60∶1、30∶1、15∶1、10∶1)分别记为SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4。

1.3 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的性能测试

1.3.1 表面形貌测试

用 JSM-5610LV 型场发射扫描电镜(JEOL,日本)对镀金处理后的复合纤维膜样品进行表面形貌的观测。通过 Image-Pro Plus 6.0 软件对电镜照片进行分析,随机选取100根纤维进行测量并计算平均直径及方差。

1.3.2 化学结构测试

用 Nicolet is50 型傅里叶变换红外光谱仪(ATR-FTIR)测定不同复合纤维膜样品的红外光谱,500～4000 cm-1。

1.3.3 吸水率测试

用称重法测量复合纤维膜的吸水率[16]。将样品裁切成边长3 cm的方形并记重。将样品置于 10 mL 的PBS(pH=7.2～7.4)中,并室温放置24 h后,移除样品表面多余的水并记重。以止血纱布为对照,测量3次取平均值。由式(1)计算吸水率。

(1)

式中:A为吸水率,%;Wd为复合纤维膜干燥时的重量,g;WW为复合纤维膜吸水后的重量,g。

1.3.4 体外凝血指数测试

(2)

式中:BCI为体外凝血指数,%;A1为各组样品测得的紫外吸光度;A0为阴性对照组的紫外吸光度。

1.3.5 抗菌性能测试

用平皿扩散法[18]和平板计数法[19]测定复合纤维膜的抗菌性能,试验方法参照 GB/T 20944.1—2007《纺织品 抗菌性能的评价 第1部分:琼脂平皿扩散法》和 GB/T 20944.3—2008 《纺织品 抗菌性能的评价 第三部分:振荡法》,测试菌种选用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。样品的抗菌性能以抑菌圈直径和抑菌率表征。

抑菌圈:将液态无菌琼脂培养基倒入培养皿中,待其冷却固化后,取适量菌液在平板上均匀地涂板,并将复合纤维膜制成直径6 mm的圆形试样,将其分别置于培养皿的中间位置,37 ℃恒温密封培养。24 h后,用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小,每组进行3次测量。

抑菌率:将50 mg的样品置于已培养的菌悬液中,振荡菌悬液使细菌均匀分布。24 h以后进行稀释,再移取10 μL菌液涂平板并密封。将平板倒置于37 ℃恒温箱中,24 h后计数平板上的菌落数。每组进行3次测量。由式(3)计算抑菌率。

(3)

式中:R为抑菌率,%;Nm为各组样品平板上的菌落数,个;N0为未放样的空白对照平板上的菌落数,个。

2 结果与分析

2.1 表面形貌表征

不同质量比的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的形貌特征如图2所示。从图2中可以看出,与未浸泡乙醇的纯丝素纤维膜SF(图2(a))相比,浸泡后的纯丝素蛋白纤维膜SF(图2(b))呈致密网状结构,从图2(c)—(f)可以看出,丝素蛋白/茜草素复合纤维膜中的纤维均呈光滑致密、无串珠网状结构。与纯丝素蛋白纤维膜SF(0.61±0.22) μm相比,SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4的平均直径分别为(0.63±0.20)、(0.60±0.21)、(0.61±0.19)、(0.63±0.18) μm,说明加入茜草素后复合纤维膜的纤维直径没有明显的变化。但当丝素蛋白与茜草素质量比为15∶1时,纤维网中出现明显的纤维断裂,复合纤维膜的机械性能降低。

图2 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的SEM照片Fig.2 SEM photos of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.2 化学结构分析

不同质量比的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的红外光谱测试结果如图3所示。从图3中可以看出,复合纤维膜在1625 cm-1处左右对应丝素蛋白酰胺I的吸收峰,呈现出典型的β折叠结构,这种构造使得复合纤维膜在水中不溶解[20]。与纯丝素蛋白纤维膜SF相比,复合纤维膜在1380、1100、930 cm-1处出现新的特征吸收峰,对应的可能是茜草素苯环上的碳氢键的面外弯曲振动、C—H面内弯曲振动和C—H面外弯曲振动。此外,随着茜草素含量增加,复合纤维膜在3280 cm-1处的O—H和N—H基团重叠的伸缩振动峰的强度减弱。以上峰值变化说明丝素膜中存在茜草素(1,2-二羟基-9,10-蒽二酮)[21],且没有新物质产生。

图3 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的红外谱图Fig.3 FTIR spectra of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.3 吸水率分析

图4 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的吸水率Fig.4 Water absorption of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.4 体外凝血指数分析

不同质量比的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的体外凝血指数(BCI)测试结果如图5所示。从图5(a)中可以看出,复合纤维膜可以吸收血液使其凝固成血凝块并沉降在离心管的底部,随着茜草素含量的增加,上清液的颜色逐渐变淡,表明复合纤维膜吸收血液使其凝固的能力增强。从图5(b)可以看出,与止血纱布对照样的BCI值(80.01±1.38)%相比,SF(70.95±0.49)%、SF-A1(54.27±0.74)%、SF-A2(42.27±0.38)%、SF-A3(31.15±0.60)%和SF-A4(22.74±0.74)%的BCI值逐步减少,数据差异具有统计学意义(P<0.05),表明制得的复合纤维膜的体外促凝血能力均优于止血纱布。其中SF-A4能够在很短的时间内使血液凝固,表现了极好的凝血能力。这归因于茜草素可以缩短凝血酶原转化为凝血酶的时间,使血液凝固时间缩短,有效提高止血效果[24]。同时复合纤维膜具有较高的吸水率(图4),与血液接触时能够快速吸收水分子加速血液凝固,因此SF-A4复合纤维膜有较低的体外凝血指数,止血作用明显增强。

图5 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的体外凝血性能Fig.5 In vitro coagulation activity of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.5 抗菌性能分析

不同质量比的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的抑菌圈测试结果如图6所示。平皿扩散法是衡量抑菌效果的定性方法[18]。从图6中可以看出,纯丝素蛋白纤维膜SF对金黄色葡萄球菌(6.81±0.31)mm和大肠杆菌(6.43±0.22) mm都仅具有轻微的抗菌性能。SF-A1、SF-A2、SF-A3和SF-A4对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别是(7.90±0.01)、(9.27±0.04)、(10.57±0.01)、(12.23±0.01) mm;SF-A1、SF-A2、SF-A3和SF-A4对大肠杆菌的抑菌圈直径分别是(7.53±0.01)、(8.73±0.04)、(9.30±0.04)、(11.47±0.09) mm,数据差异具有统计学意义(P<0.05)。由此可知,在相同的实验条件下,复合纤维膜对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于大肠杆菌,而且随着茜草素含量的增加,复合纤维膜的抗菌性越好。茜草素具有一定的抗菌效果,其抑菌机制主要是通过抑制细菌的细胞壁合成、抑制细菌蛋白质合成等方式来阻止细菌的生长和繁衍[24]。

图6 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈大小Fig.6 Inhibitory zone size of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane against S.aureus and E.coli

不同质量比的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的抑菌率测试结果如图7所示。平板计数法是一种定量判断材料抗菌率的方法[19]。从图7(a)—(b)可以看出,与空白对照相比,纯丝素蛋白纤维膜SF的琼脂平板上菌落数量减少但仍能观察到大量菌落,说明纯丝素蛋白纤维膜SF对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的抑制作用但效果并不明显。随着茜草素含量的增加,SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4琼脂平板上生长的菌落数量逐渐减少,表明复合纤维膜抗菌性能与茜草素的含量呈正相关。其中在复合纤维膜SF-A4的琼脂平板上仅观察到少量菌落,抑制了大部分菌落的形成,对金黄色葡萄球菌(98.03±0.28)%和大肠杆菌(92.02±1.03)%均有很强的抑制作用。但当丝素蛋白/茜草素质量比超过15∶1时复合纤维膜的机械性能变差,纤维出现断裂(图2),因此综合茜草素用量、凝血效果和抗菌性,本文实验没有进一步制备更高质量比的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜。

图7 丝素蛋白/茜草素复合纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性能Fig.7 Bacteriostatic performance of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane against S.aureus and E.coli

3 结 论

本文以茜草素为止血抗菌剂,通过静电纺丝法制备了丝素蛋白/茜草素复合纤维膜,并探讨分析了不同质量比条件下得到的丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的微观形貌、吸水率、止血性能、抑菌性能。得到的主要结论如下:

a)丝素蛋白/茜草素复合纤维膜止血性能实验表明,采用静电纺丝制得的复合纤维膜具有较高的吸水率,有利于快速吸收水分子加速血液凝固,不同质量比丝素蛋白/茜草素复合纤维膜的体外促凝血能力均优于止血纱布。其体外凝血指数较小,体外凝血时间较短,止血性能优于止血纱布。

b)丝素蛋白/茜草素复合纤维膜抗菌性能与茜草素的含量成正相关,当丝素蛋白与茜草素的质量比为10∶1时,丝素蛋白/茜草素复合纤维膜具有较好的抗菌性能,对大肠杆菌的抑菌率为(92.02±1.03)%,对金黄色葡萄球菌的抑菌率为(98.03±0.28)%。