免疫层析信号放大技术及其在生物医药领域应用的研究进展

贾轶静，唐毓婧，李晓敏，邓莹楠，周 陇，郭子芳

（中石化（北京）化工研究院有限公司 中国石化医用卫生材料研究与应用重点实验室，北京 100013）

免疫层析测定（ICA）是一种基于特异性抗原-抗体识别反应检测目标分析物的方法，具有高特异性和准确性，已经成功实现了对复杂生物体中蛋白质、激素、核酸、药物等物质的快速灵敏检测[1-3]。与传统的实验室检测方法相比，ICA具有成本低、操作简单、分析时间短、特异性强和结果容易判读等特点，是应用最广泛的免疫学检测技术，对于疾病的早期临床诊断具有重要的应用价值[4-6]。随着体外免疫诊断技术的不断更新，对ICA的灵敏度、准确度和特异性提出了更高的要求[7]。然而，传统的ICA将免疫技术和色谱层析技术相结合，检测灵敏度相对较低，通常仅可实现定性和半定量的检测，无法满足实际生物分析应用中低丰度物质的检测需要[8]。值得注意的是，微弱的输出信号和基质干扰是ICA实现精准检测面临的主要挑战[9]。因此，迫切需要开发信号放大策略以提高检测灵敏度，进一步增强生物传感能力，从而满足当前对生物医药、临床诊断、食品安全、环境监测等领域的检测要求。

本文介绍了ICA的基本原理以及增强分析信号的方法，总结了免疫标记材料的选择及该技术在生物医药领域中的应用研究进展，同时对未来的研究方向进行了展望，以期为免疫层析信号放大技术的发展提供参考。

1 ICA的原理

ICA主要借助免疫层析试纸条完成，是一种采用有色或发光纳米颗粒等材料标记抗体作为信号标签的膜基快速检测平台，也是即时诊断（POCT）领域最常采用的技术[10-11]。免疫层析试纸条的典型结构见图1，主体包括五部分：试样垫、结合垫、检测线、控制线和吸收垫。结合垫包含免疫标记材料与特异性抗体共轭生成的免疫标记试剂。将待测物滴到试样垫上，通过毛细作用在层析试纸条上移动，到达结合垫后，待测物与免疫标记试剂反应形成免疫标记结合物，然后移动至检测线区域，与检测线上包被的抗原或抗体发生特异性结合而被截留，聚集在检测线上，通过肉眼或与荧光仪等仪器联用可以判读检测结果。

图1 免疫层析试纸条的典型结构Fig.1 Typical structure of lateral flow immunochromatographic test strip.PVC：polyvinyl chloride.

根据待测分子的大小和结合方式的不同，ICA主要分为双抗体夹心法和竞争法。双抗体夹心法适用于较大分子量或具有多个结合位点的分析物，例如各种蛋白质等大分子抗原；竞争法适用于小分子物质，例如半抗原、激素以及药物。双抗体夹心法的原理是大分子抗原分别与两种抗体结合，利用捕获抗体（固定于结合垫）和检测抗体（固定于检测线）在试纸条上形成夹心复合物，通过标记物产生的响应信号进行测定[12]。以胶体金ICA为例，如果试样中不含待测抗原，仅控制线显色，结果为阴性；如果检测线和控制线均显色，结果为阳性，控制线的作用是用来验证检测结果是否有效。如果是具有单一抗原决定簇的小分子量分析物，不能同时与两种抗体结合，则采用竞争法[13]。在竞争法测试中，检测线用待测抗原或抗原类似物处理，小分子会阻断检测线上抗体的结合位点。以胶体金ICA为例，若样本为阳性，则检测线不显色，控制线显色；若样本为阴性，则检测线和控制线都显色。检测线颜色强度与待测物的含量成反比。

2 免疫层析信号放大技术

ICA可对靶标分子实现可视化、现场快速筛选，灵敏度与免疫标记材料的光学性能和免疫测定的信号输出模式紧密相关[14]。新型光学材料的不断涌现，不仅为ICA的发展提供了内生动力，而且推动ICA向高特异性和高灵敏度的方向发展，实现从定性至定量检测的转变。

此外，免疫测定的模式影响信号输出的形式和检测灵敏度。通过合理的结构设计，将两种或多种信号放大策略组合到一个ICA系统中，可以实现更低的检测限和更高的灵敏度[15]。因此，基于ICA免疫测定模式设计的信号放大策略在高灵敏度、小型化的免疫传感系统的开发中发挥着重要作用，特别是在疾病早期用于痕量的特定生物标志物的检测。免疫层析的信号放大策略主要基于免疫标记材料以及免疫测定模式设计。

2.1 基于免疫标记材料的信号放大策略

纳米材料由于优越的信号放大作用，可以克服传统材料的不足，达到良好的灵敏度和特异性从而备受青睐[16-18]。胶体金具有合成简单、比表面积高、化学性质稳定和易被修饰等特性，是使用最广泛的ICA标记材料。目前，以胶体金作为示踪标志物的免疫标记技术在病毒、抗生素以及真菌毒素等检测方面已得到广泛应用，但它的灵敏度偏低，可能会导致假阴性[8]。为了拓宽ICA的应用范围，需要选择信号强度更高的纳米标记材料。到目前为止，已开发出多种纳米材料，包括量子点、荧光碳点、上转换纳米颗粒（UCNPs）、时间分辨荧光微球、磁性纳米颗粒、纳米酶，并创新地应用于ICA，以提高灵敏度。

2.1.1 量子点

作为纳米级荧光标记材料，量子点通常由ⅡB和ⅥA族元素组成，具有发射光谱窄、Stocks位移大、量子产率高、光化学稳定性好、可以减弱甚至消除背景荧光干扰等优点，被视为ICA中有前途的标记物[16，19]。许多研究已经将基于量子点的ICA用于医学诊断和食品安全中分析物的超灵敏检测，但是检测时需采用紫外光作为激发光源，仪器设备要求较高，操作步骤稍显复杂，检测成本较高。李朝辉课题组[20]使用生态友好型Cu-Zn-In-S/ZnS量子点作为信号报告物，开发了一种基于量子点的环境友好型荧光免疫试纸条，用于简单、快速、高灵敏地检测破伤风抗体。此外，熊勇华课题组[21]通过微乳液技术封装CdSe/ZnS量子点合成了增强型荧光探针量子点珠（QB），克服了单量子点仅包含单个抗原-抗体相互作用的缺点。使用QB-ICA传感器时黄曲霉毒素B1的检测限比先前报道的基于金纳米颗粒的ICA的检测限高约2个数量级，检测信号得到显著放大。

2.1.2 荧光碳点

荧光碳点是一类新型的无机碳发光材料，凭借合成简易、发光性能优异、生物相容性好、尺寸小、化学惰性强、易于表面修饰等优点，成为生化传感、光学成像及疾病诊疗的理想平台[22]。然而，作为ICA标记探针，小尺寸的碳点主要面临两个挑战：一是表面生物修饰位点有限，且生物偶联时会存在单个抗体同时偶联多个碳点而导致荧光淬灭；二是单个碳点的荧光强度整体偏弱。针对上述问题，郑建萍课题组[23]开发了一种一步碳化与高分子交联制备荧光碳点的合成技术，制备出单分散、尺寸均一、量子效率高的荧光碳点，并证实了它在高灵敏免疫层析生物标记平台的构建及食源性污染物快速筛选中的重要应用潜力。

2.1.3 UCNPs

UCNPs通常由无机基质和稀土掺杂离子组成，具有低自体荧光、高抗光漂白性、反Stocks光致发光特性，并且可以消除生物试样中的背景荧光，从而提供优异的信噪比，已被用作ICA标记探针[24]。然而，它的光致发光效率低、亲水性修饰效果弱以及与抗体结合性能较差，这是它用于ICA的重大挑战。段宏伟课题组[25]研究了UCNPs的合成、表面修饰以及与抗体偶联策略，通过亲水改性方法制备出高亲和力的核壳型探针，不仅保留了UCNPs在生物试样检测中的优良基质耐受性，而且在灵敏度、定量检测范围和成本方面均有所提高。

2.1.4 时间分辨荧光微球

时间分辨荧光微球作为一种特殊的功能微球，内部包埋稀土-镧系元素（如Eu3+，Tb3+，Sm3+，Dy3+）[26]。与普通荧光相比，时间分辨荧光具有更长的荧光寿命，Stocks位移大，可以消除背景干扰，实现更灵敏及特异性的测定[27]。将时间分辨荧光微球用于ICA的瓶颈是如何在荧光微球表面修饰合适密度的功能基团，用于与蛋白质或抗体的共价偶联，从而提高标记物的稳定性。时间分辨荧光ICA对仪器设备要求较高，分析成本相对较高。李培武院士课题组[28]制备了具有增强荧光的新型Eu/Tb（Ⅲ）纳米球，作为标记物与抗独特型纳米抗体、单克隆抗体偶联并用于时间分辨荧光ICA，首次实现玉米中双真菌毒素的快速、定量和同时检测，具有较高创新性。

2.1.5 磁性纳米颗粒

磁性纳米颗粒通常由铁、钴、镍等金属氧化物组成，具有稳定、无毒、不易褪色、良好的磁导向性等特点[29]。作为免疫磁性分离剂，通过从多组分溶液中快速地富集和纯化分析物，可以显著降低基质效应。由于生物试样中的磁性背景可忽略不计，信噪比极高，磁性纳米颗粒也可作为免疫分析中的标记探针。但是利用磁性纳米颗粒标记建立的ICA快速检测技术需要借助外界磁场，实现信号富集。Bragina等[30]提出了结合磁性纳米颗粒不同功能的ICA平台，不仅避免了耗时的试样制备，可有效进行预浓缩和磁富集，还可作为免疫复合物载体沿测试条迁移，成功用于食物中病原体的检测。

2.1.6 纳米酶

纳米酶由特殊结构的无机或有机纳米材料组成，能够模拟天然酶的生物催化功能，具有催化稳定性高、制造成本低、易于调控、耐pH/温度等特点[6，7，31]。采用纳米酶作为信号标签，能够整合由原始颜色产生的视觉比色信号和由过氧化物模拟酶活性产生的催化信号。此外，纳米酶催化产生的信号通常较比色信号更敏感，不仅显著提高了灵敏度，而且拓宽了检测范围[32]。将纳米酶作为信号供体集成到ICA系统中，提供按需定量分析模式，可以满足不同场景的检测要求，有效提高ICA检测的分析灵敏度。王建龙课题组[33]建立了具有良好生物相容性、易于功能化修饰的磁性纳米酶介导的双读数按需免疫分析平台，具有较好的重复性和可靠性，可满足对同一目标的不同检测限要求。

2.2 基于免疫测定模式设计的信号放大策略

免疫层析试纸条的检测性能与测定模式有关。为了满足快速和超敏生物测定的要求，可以通过纳米材料表面修饰、优化信号输出方式、改变检测线上固定抗原或抗体的种类以及增加试样预处理过程降低基质效应，从而提高ICA测定的灵敏度。

2.2.1 纳米材料修饰蛋白酶标记策略

在ICA中，除量子点、UCNPs、纳米酶等标记材料外，最有前途的信号增强工具之一是蛋白酶，特别是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶。纳米材料修饰蛋白酶标记策略是将纳米材料同时标记单克隆抗体和蛋白酶得到双标记探针，结合蛋白酶高效的催化作用，使检测线颜色加深，显著增强检测效果[9，12-13，34]。张学记课题组[35]采用HRP作为扩增工具，设计了一种基于双标记纳米探针的酶扩增ICA生物传感器，用于miRNA-224可视化检测。将DNA识别探针和HRP信号放大酶同时固定在金纳米颗粒表面构建酶基双标记纳米探针，通过靶标miRNA-224与DNA识别探针在检测线区域形成“夹心结构”。HRP与酶底物之间的酶促反应会产生蓝色产物，这些产物沉积在纳米探针表面，以增强检测线的视觉效果和响应强度，检测限比单标记ICA提高了10倍。

2.2.2 双信号读数比率测定策略

双信号读数的自校准能力已被广泛认为可以显著提高免疫测定的准确性、灵敏度和抗干扰能力[15，31-32，36]。产生比率信号的传统方法是荧光/生物发光共振能量转移（FRET/BRET）。由于供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠，能量转移效率会受到供体与受体距离的严格限制。因此，FRET/BRET用于ICA存在限制。基于三原色理论产生比率信号的新方法不需要激发光，对检测条件的要求较低，不需考虑示踪物之间的距离和光谱的限制，同时可在复杂的光环境下保持检测结果的准确性。华修德课题组[37]以苯噻菌酯为典型对象，将竞争和非竞争免疫分析集成在同一免疫层析试纸条上，检测线颜色随分析物浓度的变化呈现不同的变化，比率信号使其在定量检测时表现出更高的灵敏度和准确度。

2.2.3 降低基质效应信号放大策略

在传统的免疫色谱法中，ICA条带中检测线都是靶向特异性的，其中特异性抗原或抗体被固定在检测线上。由于空间位阻，检测线上的抗原或抗体固定可能会减少有效识别位点的数量，因此限制了它的灵敏度。检测线上的免疫识别反应的时间间隔有限且不可控，也会对灵敏度产生负面影响。增加试样前处理过程，有效降低基质效应，或将ICA测试与免疫反应分开，可以实现信号放大[4，29-30]。王升启课题组[38]设计了一种通用结构作为ICA传感器，在检测线中使用抗原作为双功能元件和抗白蛋白抗体建立了通用的超灵敏QB-ICA传感器。该研究建立了基于三氯乙酸的快速预处理方法，有效降低了基质效应；引入预孵育用于竞争性识别，充足的竞争识别时间有效提高了灵敏度。在检测线上固定抗白蛋白抗体可以使ICA条带具有非特异性，可用作所有小分子分析物的快速、灵敏和定量检测。

3 ICA在生物医药领域的应用

ICA因其用户体验友好、检测时间短、成本低、操作简便等优点成为一种新兴的生物分析技术。目前ICA在病毒、致病菌、生物标志物、真菌毒素以及药物残留检测方面已得到广泛应用，更好地发挥了即时检测技术在生物医药领域的作用。

3.1 病毒检测

随着对COVID-19临床特征和SARS-CoV-2传播途径的研究，了解到新型冠状病毒的潜伏期可长达24 d，且具有很高的基本生殖数[39-41]。早期和快速地检测SARS-CoV-2对控制病毒传播至关重要。新型冠状病毒抗原检测不仅可以有效提高快速诊断的准确性，为治疗方法提供指导，而且有助于揭示感染机制，便于病毒的溯源。阎锡蕴院士课题组[42]将纳米酶和化学发光免疫分析相结合，开发了一种基于纳米酶的新型化学发光免疫检测方法，为SARS-CoV-2抗原检测提供了一种高灵敏度的即时检测方法，这将大大促进SARS-CoV-2感染的早期筛查。

3.2 致病菌检测

细菌感染性疾病是一种由病原菌感染引起的临床常见疾病，在环境卫生恶劣或经济不发达的国家和地区尤为普遍，引发的系列并发症严重危及患者生命[5]。金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可引起人和多种动物发生胃肠道或尿道等多种局部组织器官感染[43]。程楠课题组[44]合成了介孔核壳结构Pd@Pt纳米酶，Pt与Pd掺杂形成的双金属纳米颗粒作为过氧化物酶模拟物，可以增强与显色底物的反应接触面积，并将其作为信号放大器用于金黄色葡萄球菌比色免疫检测。该研究巧妙地使用色度计实现了便携式信号输出，有望在食品安全监管和生物医学领域得到广泛应用。

3.3 生物标志物检测

生物标志物能够反映正常生理过程或病理过程的生物特征，具有良好的靶向性，广泛用于疾病诊断、治疗和生物医学工程领域[11，27]。血清中的S-100β蛋白质被认为是一种客观定量生物标志物，可用于创伤性脑损伤（TBI）的早期诊断以及严重颅脑损伤的预后判断。吴年强课题组[45]利用表面增强拉曼散射技术开发了一种具有等离子体“热点”增强作用的免疫层析试纸条，提供了一种能快速检测血清S-100β蛋白的便携式设备，可突破当前检测方法的限制，用于急诊室中TBI的快速筛查。此外，通过改变抗体种类，该方法还可用于血清中其他微量蛋白质生物标志物的直接检测。

3.4 真菌毒素检测

真菌毒素通常是由污染谷类作物、动物饲料或食品中的真菌产生的代谢产物，可引发严重的健康问题[21，28]。黄曲霉毒素B1作为最常见的霉菌毒素，具有免疫毒性、诱变性和致癌性，可能导致整个食物链被污染，从而造成重大经济损失[46]。灵敏、低成本、快速和现场分析检测真菌毒素是减少粮食损失、保护人类健康和环境安全的重要预警工具。李培武院士课题组[47]制备了一种具有高效催化性能的Fe-N-C单原子纳米酶，并成功地将其作为霉菌毒素横向流动免疫检测的标记物和催化剂。利用催化扩增系统，通过肉眼或智能手机观察检测线颜色变化，可以轻松灵活地定性和定量检测黄曲霉毒素B1。

3.5 药物残留检测

药物的过量使用可能会使其在动物源性食品中残留，并通过食物链在人体蓄积，从而导致抗生素耐药性、过敏反应和致畸性[9，15]。磺胺嘧啶是一种合成的小分子磺胺抗生素，被广泛用于兽医临床治疗。为保证食品安全，需要简单、快速的现场检测技术来监测磺胺嘧啶残留量，以避免对人体健康造成潜在的危害。赖卫华课题组[48]提出了一种基于内滤效应引起的聚多巴胺纳米球双光谱重叠荧光猝灭的横向流动免疫分析法，该方法对目标分析物浓度的变化更为敏感，可以同时提供包括荧光信号、灰度信号和比色信号在内的三种模式信号输出，可以在不同条件下灵活地应用于磺胺嘧啶的检测。

4 结语

ICA具有便携、低成本、易于操作等特点，非常适用于现场检测和即时检测，被广泛用于生物医药领域中致病菌、真菌毒素、药物残留等现场紧急检查以及疾病的快速诊断等。ICA的检测限与所用的标记探针、免疫测定模式密切相关。随着新型标记材料和创新性免疫测定模式等信号放大策略的引入，ICA检测灵敏度得到有效提升，从而在POCT方面发挥更重要的作用。因此，深入了解免疫层析信号放大技术有利于先进ICA传感器的设计。

尽管ICA已取得了实质性进展，但仍然存在若干问题需要进一步详细研究，以满足在实际的传感应用中定量、高灵敏度、多联检测的需求：1）研究制备简单，具有高稳定性、优异水溶性和足够结合位点的新型标记材料。例如，具有广谱吸收和特定表面积的复合材料、具有高稳定性并易于化学修饰的脂质体。2）研究具有高通量和高灵敏度测定模式的新型信号放大策略，是检测低丰度生物分子的迫切需求。例如，DNA扩增和纳米扩增策略的整合将是解决瓶颈的有效途径。3）研究数字化检测技术，构建满足多项目同时快速检测的便携式ICA传感平台。例如，与手持式仪器和微型设备集成（如pH计、血糖仪、磁阅读器、智能手机、多通道测量的电极阵列和芯片），产生实时信号，制造便携式POCT传感器，促进设备的商业化。

综上，随着标记材料和分析技术的发展，ICA有望在细胞分析和生物诊断中达到更高效、灵敏、精准的水平，从而在生物医药领域发挥更大的作用。