乳酸菌混合发酵在红枣浆中的发酵特性研究

陈晓维,温靖,肖更生,徐玉娟,吴继军,余元善,邹波,李璐,卜智斌

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业农村部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东 广州,510610)

红枣(ZiziphusjujubaMill.)为鼠李科枣属植物果实,原产于亚洲和南欧[1]。红枣果实成熟后变为红色,呈椭圆形,略有光泽,有不规则褶皱,果质松软,果味甘甜,被列为“五果”(桃、梅、李、枣、杏)之一,素有“木本粮食”之称[2]。红枣富含蛋白质、氨基酸、维生素以及矿物质等多种营养成分。此外,红枣中还存在许多化学成分,包括多糖、类黄酮、皂苷和环状核苷酸等,这些化学成分已被证明具有多种生物活性,如抗炎、抗癌、抗氧化、对造血功能和大脑神经有益并且具有调节肠道菌群作用等[3-4]。我国是全球主要的红枣生产国,产量占全球90%以上[5]。

乳酸菌具有调节肠道菌群、增强人体免疫力、降低血清胆固醇等多种功能[6]。国内外研究学者利用干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等常见的乳酸菌对单一或复合果蔬汁进行发酵,均取得了较好的效果[7-10]。发酵红枣浆作为红枣的一种加工产品,风味独特,枣香浓郁,保留了红枣中的多酚、有机酸、多糖等功能成分,符合消费者追求天然、健康的食品趋势,具有一定的市场效益与发展潜力。目前,发酵红枣浆的报道主要集中在不同乳酸菌的单株发酵特性、乳酸菌发酵工艺优化、乳酸菌复合酵母菌发酵酒醋工艺等方面[10-12]。关于乳酸菌混合发酵红枣浆的报道还比较少[13],且尚未见关于对不同乳酸菌混合发酵后红枣浆的营养功能成分(多酚、黄酮、多糖、抗坏血酸和有机酸等)和抗氧化活性变化的相关报道。

本文以红枣浆为原料,通过添加3种不同益生菌(干酪乳杆菌和植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的复合菌进行混合发酵,旨在为开发新型功能性乳酸菌发酵红枣浆提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

骏枣(去核),新疆西圣果业有限公司;干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌,本实验室保藏;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、抗坏血酸、没食子酸、芦丁,上海源叶生物有限公司;MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)肉汤、MRS琼脂培养基,广东环凯有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

WF-A2000型榨汁机,美的集团公司;RP-101折光仪,日本爱宕有限公司;PB-10型pH计,德国Sartorius公司;SPX-250B-Z生化培养箱,上海博讯实业有限公司;SW-CJ-2FD无菌操作台,苏州安康空气技术有限公司;Biofuge Stratos Sorvall高速冷冻离心机,美国Thermo Fisher Scientific公司;UV1800紫外分光光度计,日本岛津公司;UltraScan VIS 全自动色差仪,美国HunterLab公司;HWS电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红枣浆的制备

挑选无霉变的去核红枣,料水比1∶3(g∶mL)加入纯净水,在蒸笼中蒸煮20 min后用打浆机打浆,获得的红枣浆分装到玻璃瓶中,将分装好的红枣浆放入水浴锅中进行灭菌处理(90 ℃,5 min)。杀菌后贮藏于-20 ℃冷库中备用。

1.3.2 乳酸菌培养物制备

从-80 ℃冰箱中取出保藏的3种乳酸菌(干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的甘油管,在超净工作台中进行MRS固体培养基中划线,将划线的MRS固体培养基置于培养箱中,37 ℃培养48 h,挑取各乳酸菌的菌落分别接种于MRS液体培养基,置于振荡培养箱于37 ℃、150 r/min培养12 h至菌液吸光度(OD)为4。

1.3.3 红枣浆的乳酸菌发酵培养

红枣浆解冻后,置于超净工作台上,分别在已灭菌的250 mL三角瓶中加入100 g红枣浆,每瓶分别接入干酪乳杆菌+植物乳杆菌、植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌+植物乳杆菌的乳酸菌培养物(接种量为红枣浆质量的1%),置于37 ℃的振荡培养箱中振荡培养,每8 h取样1次,测定其菌落总数;并根据绘制的微生物生长曲线确定发酵终点,测定发酵前后的理化指标。

1.3.4 乳酸菌活菌数的测定

参考GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》采用稀释倒平板法测定乳酸菌菌落总数。

1.3.5 pH和可滴定酸的测定

pH值使用pH计直接测定。可滴定酸的测定按照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》,采用pH计电位滴定法进行测定,总酸度以乳酸计。

1.3.6 红枣浆色差的测定

采用色差仪测定红枣浆样品发酵前后的色泽(L、a和b值表示),结果用总色差ΔE表示,按公式(1)计算:

(1)

式中:L0、a0、b0表示未发酵红枣浆的色泽参数;L、a、b表示发酵红枣浆的色泽参数。

1.3.7 总酚含量的测定

采用福林酚法测定[14],结果以没食子酸当量表示。

1.3.8 总黄酮的测定

参照WU等[15]的方法,稍作修改。总黄酮含量用芦丁表示。

1.3.9 多糖含量的测定

采用苯酚硫酸法测定[16],结果以葡萄糖表示。

1.3.10 有机酸和抗坏血酸的测定

参考WU等[15]的方法,采用高效液相色谱进行测定。抗坏血酸检测波长为254 nm,有机酸检测波长210 nm,并采用外标法定量。

1.3.11 DPPH自由基清除力的测定

参照ZOU等[17]的方法并略作修改,样品清除DPPH自由基的能力以1 g样品清除Trolox的质量相当,以mg/g表示。

1.3.12 ABTS阳离子自由基清除力的测定

1.4 统计分析

所有的不同处理均重复3次,数据结果采用SPSS 23.0进行方差分析,数值以平均值±标准差表示,并用Origin 8.5.1软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌混合发酵期间红枣浆中乳酸菌数量的变化

从图1可知,在发酵0～24 h,乳酸菌活菌数呈对数增长,发酵24 h后进入稳定的生长期,3种复合乳酸菌的活菌数均可达到9.4 lg CFU/mL以上。其中,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌复合发酵的红枣浆中活菌数高于其余2组,这可能是由于不同乳酸菌种的差异所致。在发酵24 h后,3种复合乳酸菌在红枣浆中的活菌数均呈下降趋势,这是由于红枣浆中的碳源随发酵时间的延长被消耗以及乳酸菌发酵产酸引起的环境变化,抑制了乳酸菌的生长[19]。综上,红枣浆营养丰富,3种复合乳酸菌均能在红枣浆中较好的生长繁殖。为了使发酵红枣浆中含有较高的益生菌活菌数,选择发酵24 h为发酵终点,分析比较了不同乳酸菌混合发酵前后(发酵0 h和发酵24 h)对红枣浆的理化指标、营养功能成分和抗氧化活性的影响。

2.2 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆pH和可滴定酸的变化

由图2可知,红枣浆的最初pH值约为4.79。在发酵24 h后,3种混合乳酸菌发酵的红枣浆中的 pH 值均呈下降趋势,这主要是由于在发酵过程中产生了醋酸和乳酸等代谢物。其中,干酪乳杆菌和植物乳杆菌发酵的红枣浆的pH最大,而植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵的红枣浆的 pH 值最小。经发酵24 h,红枣浆pH值显著降低,从而抑制乳酸菌菌株的生长和繁殖,导致乳酸菌的生长能力下降,与上述2.1节乳酸菌生长曲线中发酵24 h后活菌数下降的趋势一致。这些结果与之前对植物乳杆菌发酵的红枣汁的研究结果一致[19]。

a-pH;b-可滴定酸图2 不同乳酸菌混合发酵后红枣浆pH和可滴定酸的变化Fig.2 Changes in pH and titratable acids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

从图2可知,红枣浆的初始可滴定酸含量为4.29 mg/g。发酵24 h后,3种混合乳酸菌发酵红枣浆所产生的可滴定酸均呈现出上升趋势。3种乳酸菌混合发酵的红枣浆在发酵后可滴定酸含量均达到6.7 mg/g(以乳酸计)左右,产酸能力较为明显,其中植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵的红枣浆总可滴定酸含量最高,但3组无显著性差异。

2.3 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆色差的变化

由图3可知,发酵24 h后,不同乳酸菌混合发酵的红枣浆的色差值大体上均呈增大的趋势。其中,干酪乳杆菌+植物乳杆菌混合发酵的红枣浆的色差值最大,为1.22;植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌混合发酵的红枣浆的色差值最小,为0.21。环境(发酵时间、发酵温度)的影响、乳酸菌对红枣浆的发酵利用以及相关物质的产生,使得发酵后红枣浆的色泽发生了一定的改变,但具体的变化原因与方式尚未明确,还需进一步的探究[20]。研究显示,经植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵对红枣浆的色泽影响较小,发酵后红枣浆的色泽与未发酵的红枣浆颜色更接近。

图3 不同乳酸菌混合发酵后红枣浆色差的变化Fig.3 Changes of jujube pulp color difference after mixed fermentation with different strains

2.4 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆总酚的变化

由图4可知,在发酵24 h后,3种红枣浆的总酚含量均呈上升趋势。其中,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌混合发酵的红枣浆的总酚含量最高,为0.62 mg/g,而干酪乳杆菌+植物乳杆菌混合发酵的红枣浆的总酚含量最低,为0.57 mg/g。王琪[21]报道了经乳酸菌发酵的红枣汁的总酚浓度高于未发酵红枣汁。RICCI等[22]对无花果汁进行发酵,发现发酵无花果汁的总酚含量高于未发酵组。发酵后红枣浆中总酚含量的显著增加可能是因为发酵使植物细胞释放出一些可溶性或不可溶性的酚类化合物。

图4 不同乳酸菌混合发酵后红枣浆总酚的变化Fig.4 Changes in total phenolics of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.5 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆总黄酮的变化

如图5所示,在发酵24 h后,3种红枣浆的总黄酮含量均有所增加。其中,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌混合发酵的红枣浆的总黄酮含量最高,相比未发酵组增加了16.28%;而干酪乳杆菌+植物乳杆菌混合发酵的红枣浆的总黄酮含量最低,增加了6.52%。-DOR-DEVIE等[23]也报道了乳酸菌在发酵过程中会产生葡萄糖苷酶,有可能促进了小麦和玉米秸秆提取物总黄酮含量的增加,与本研究结果一致。

图5 不同乳酸菌混合发酵后红枣浆总黄酮的变化Fig.5 Changes in total flavonoids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.6 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆多糖的变化

红枣多糖是红枣中最重要的营养功能成分之一,具有抗癌、抗炎、增强免疫力和保护肝脏等多种药理活性[4]。如图6所示,发酵24 h后,3种红枣浆中多糖含量均明显高于未发酵组。其中,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌复合发酵的红枣浆中多糖含量最高,与其余2组比较差异不显著。发酵后红枣浆多糖含量的增加可能是由于乳酸菌在发酵过程中产生胞外多糖。WANG等[24]研究报道了植物乳杆菌HW47和YW11能够产生胞外多糖,与本研究结果一致。

图6 不同乳酸菌混合发酵后红枣浆多糖的变化Fig.6 Changes in polysaccharides of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.7 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆抗坏血酸和有机酸的变化

从表1可知,红枣浆中的抗坏血酸含量经发酵后略微下降但无显著差异,说明乳酸菌发酵对红枣浆中的抗坏血酸影响较小。

表1 红枣浆经不同乳酸菌混合发酵后抗坏血酸和有机酸的变化 单位:mg/gTable 1 Changes in ascorbic and organic acids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

在发酵果蔬汁中,益生菌能分解糖生成有机酸,同时有机酸也是微生物的重要次生代谢产物[22]。红枣浆中主要的有机酸分别是柠檬酸、草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸和乳酸,这与GUO等[25]的研究结果一致。发酵 24 h 后, 干酪乳杆菌+植物乳杆菌、植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌这3组混合发酵组分别产生了3.69、3.40、3.30 mg/g的乳酸,此外还分别产生了1.26、1.06、1.08 mg/g的乙酸。XU等[8]也报道了随着乳酸菌的生长,乳酸菌发酵的胡萝卜、苹果、橙子和红枣的复合果蔬汁中乳酸含量增加,这主要与乳酸菌发酵分解糖或转化柠檬酸和苹果酸有关。3种不同乳酸菌混合发酵均表现出对柠檬酸有较强的转化能力,但发酵后不同乳酸菌混合发酵结果无统计学上的差异,红枣浆的柠檬酸含量降低了84.15%左右。柠檬酸含量的降低可能是因为在发酵早期,乳酸菌将柠檬酸作为碳源被消耗的结果[19]。与柠檬酸的趋势相似,经乳酸菌混合发酵后,不同发酵组的红枣浆中苹果酸含量均呈下降趋势,其中干酪乳杆菌+植物乳杆菌转化苹果酸的能力比其余2组强,但3组无统计学上的差异。发酵后,红枣浆苹果酸含量降低可能与自身的苹果酸经过苹果酸-乳酸发酵途径被代谢转化有关[19],经发酵24 h后,红枣浆中酒石酸含量有所增加,但与发酵前对比,差异不显著。草酸经发酵后含量也稍有下降,其中植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌发酵组的红枣浆草酸含量最低,减少了20%。

2.8 不同乳酸菌混合发酵前后红枣浆抗氧化活性的变化

由图7可知,经乳酸菌发酵后,红枣浆的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基抗氧化能力均有所增强。其中,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌混合发酵组的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基抗氧化活性值显著高于其余2组。发酵24 h后,红枣浆的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基抗氧化活性增强可能与发酵后多酚、黄酮等生物活性成分的增加有关,与余偲等[26]的研究结果一致。以上结果表明,利用乳酸菌混合发酵可以提高红枣浆中的抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除活性;b-ABTS阳离子自由基清除活性图7 不同乳酸菌混合发酵后红枣浆抗氧化活性的变化Fig.7 Changes in antioxidant activity of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

3 结论与讨论

红枣浆营养丰富,3种不同乳酸菌两两混合均能在红枣浆中较好的生长,在发酵24 h后,3个发酵组均进入稳定生长期,活菌数均可达到9.4 lg CFU/mL。在红枣浆发酵过程中,3种不同乳酸菌混合发酵组均能产酸,其中植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌的产酸能力较强,但与其他2组无显著差异。不同乳酸菌混合发酵后红枣浆色泽存在差异,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌混合发酵的红枣浆色泽与未发酵的红枣浆颜色更接近。而在不同乳酸菌混合发酵24 h后,红枣浆中的总酚、总黄酮、多糖含量和抗氧化活性均呈上升趋势,并且不同乳酸菌混合发酵表现的能力差异很大,其中植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌在红枣浆发酵24 h后对总酚、总黄酮、多糖含量和抗氧化活性优于其余2个发酵组。此外,还对不同乳酸菌混合发酵后红枣浆抗坏血酸和有机酸的差异进行分析,发酵后红枣浆中的柠檬酸、苹果酸和草酸含量降低,乳酸和乙酸含量增加,抗坏血酸和酒石酸含量无明显变化。综上,红枣浆应以植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌混合发酵为宜。