奶酪发酵剂红曲霉的筛选及其对奶酪理化、质构和抗氧化性的影响

徐杏敏,郑远荣,刘振民*,王吉栋,王清刚

1(光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海乳业生物工程技术研究中心,乳业生物技术国家重点实验室,上海,200436)2(上海海洋大学 食品学院,上海,201306)

奶酪是一种传统发酵乳制品,种类数以千计,按照成熟菌种可分为细菌成熟、霉菌成熟和酵母菌成熟。目前,青霉、白霉常被用于制作霉菌成熟奶酪,常见的有蓝纹奶酪、布里奶酪、卡蒙贝尔奶酪(Camembert cheese)等。青霉所制备的奶酪由于蛋白水解及脂肪分解的程度较高,往往气味刺激、口感辛辣[1-2]。相比之下,白霉所制备的奶酪在气味和口味上会更加温和。同是霉菌的红曲霉,在我国虽长久以来被用于发酵食品中,例如红曲酒、红曲醋、红腐乳等[3-5],却鲜少有人将其用于奶酪加工。在具备可食用性的基础上,红曲霉还可以生产红曲色素、γ-氨基丁酸、莫纳可林K及其他生物活性化合物[6-8],益处良多。成熟一直是奶酪制作中相对昂贵的过程[9],通过改变成熟条件、筛选发酵菌株,可在不降低奶酪品质的基础上减少奶酪的成熟时间,对奶酪行业的发展具有重大意义。

本实验从上海农家自制腐乳、福建农家自制酒糟中分离红曲霉菌株,以马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基分离纯化得到红曲霉,将分离出的红曲霉与实验室提供的10株红曲霉菌株以一种新型短期成熟工艺进行奶酪制备,再通过感官风味评定筛选能带来优良风味的菌株。随后对优良风味菌所成熟的奶酪样品进行理化分析、安全分析等。实验制作了一种红曲霉成熟奶酪,加工工艺借鉴了卡蒙贝尔奶酪,在其基础上优化了加工参数,创新出一种表面红色的霉菌奶酪,命名为上海玫瑰奶酪(Shanghai Rose cheese)。本研究旨在获得适宜用于成熟奶酪且能带来优良风味的红曲霉菌株,为进一步分析红曲霉奶酪优良特征风味物质提供实验菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红腐乳,上海农贸市场;红曲酒糟,福建宁德、古田、南平农场;牛乳、稀奶油、脱脂乳,光明乳业股份有限公司;10株筛自红曲腐乳的红曲霉菌株,乳业生物技术国家重点实验室;商业发酵剂FLORA、STI-13以及凝乳酶,科汉森(中国)有限公司;马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基、琼脂粉,青岛海博生物技术有限公司;CLOVER桔霉素免疫亲和柱,北京中检维康生物技术有限公司;NaCl、NaOH、HCl、硼酸、甲基红、亚甲基蓝,国药集团化学试剂有限公司;总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法、FRAP法),上海碧云天生物技术有限公司;总抗氧化能力检测试剂盒(DPPH法),上海生工生物工程股份有限公司。

生物安全柜,美国Thermo Scientific;电子天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;HVE-50高压蒸汽灭菌锅,日本HIRAYAMA;奶酪槽,英国Armfiled;HPP 110奶酪成熟箱,德国MEMMERT;Acquity UPLC/FLR/SQD2超高效液相色谱-四极杆质谱仪,美国Waters;Agilent 1260 II高效液相色谱仪-配荧光检测器,安捷伦;KT260凯氏定氮仪,丹麦FOSS Scino;TA.XTplus质构分析仪,英国Stable Micro Systems;Spectramax M5酶标仪,美国Molecular Devices;DS-11超微量紫外分光光度计,美国DeNovix。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株分离纯化

向PDB培养基中加入1.2%(质量分数,下同)琼脂,制备PDA平板。向脱脂乳中加入1.2%琼脂,配制脱脂乳琼脂平板。取5 g红曲腐乳或红曲酒糟,于PDB培养基中,置于170 r/min、32 ℃下培养7 d,进行增菌培养。随后用接种环将PDB培养基接种于PDA于32 ℃培养7 d,再挑选疑似红曲霉菌落继续划线纯化3～5次,直至平板上仅有1种菌落。将单菌落分别接种于PDA及脱脂乳琼脂平板,32 ℃下培养7 d,记录菌落形态。最终筛选出的菌株,送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。

1.2.2 红曲霉发酵剂的准备

从PDA培养基中取少量红曲霉菌丝接种于含120 mL PDB培养基的250 mL锥形瓶中,170 r/min、32 ℃下培养7 d。随后,用装有约1 cm高度脱脂棉的5 mL注射器对培养后的菌液进行过滤。经平板计数,此时滤液中的活菌含量为106CFU/L。滤液常温保存,现用现制。

1.2.3 奶酪的制作

根据JIAO等[10]的方法稍作修改,具体工艺如下所示,整个制备及成熟过程需要严格保持卫生。

原料乳→标准化→巴氏杀菌→冷却→添加商业发酵剂→发酵至pH 6.4→添加凝乳酶→凝乳→切割→排乳清→装模成型→17%盐水腌渍→晾干→涂抹红曲霉发酵液→28 ℃有氧成熟14 d

对于奶酪的分析,取样方法为将整块奶酪的表皮与内部混合均匀后取样,所有实验重复3份。

1.2.4 感官风味评价体系构建

分别参考GALLI等[11]、XIA等[12]、DIEZHANDINO等[13]对霉菌(白霉、红曲霉、青霉)成熟奶酪的感官评定指标以及国标 GB/T 10221—2021《感官分析 术语》,对感官风味评价体系进行构建。品评小组由20人组成(10名奶酪研发人员,10名资深奶酪爱好者,皆有丰富的奶酪品评经验),评分方法如表1所示。

表1 红曲霉奶酪感官评定方法Table 1 Sensory evaluation of Monascus cheese

1.2.5 安全性及功能性物质含量的测定

桔霉素含量的测定:参考 GB 5009.222—2016 《食品安全国家标准 食品中桔青霉素的测定》。

洛伐他汀与γ-氨基丁酸含量的测定:称取200 mg样品,加入含1 mL乙醇的研磨管中,60 Hz研磨3 min后以12 000 r/min离心15 min,取上清液进行1倍稀释,对于物质含量较高的上清液样品进行100倍稀释,计算物质含量时带入相应的稀释倍数。洛伐他汀使用Waters, BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),γ-氨基丁酸使用Waters, BEH T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)。流动A相为0.1%甲酸水溶液,B相为乙腈,柱温40 ℃,流速0.25 mL/min,进样量2 μL,质谱选择离子模式m/z=104,洗脱条件如表2所示。

表2 超高效液相色谱-四极杆质谱仪梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions of UHPLC-quadrupole mass spectrometer

1.2.6 奶酪理化指标的测定

水分含量测定:参考GB 5009.3—2016 《食品安全国家标准 食品中水分的测定》的直接干燥法。

脂肪含量测定:参考GB 5009.6—2016 《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》的碱水解法。

蛋白质含量测定:参考GB 5009.5—2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法。

pH 4.6可溶性氮含量测定:参考袁然等[14]方法进行测定。

1.2.7 奶酪质构的测定

使用P/50探头,测试前与测试后速度为5 mm/s,测试速度为1 mm/s,测试距离为7 mm。根据测量结果,由仪器自带软件进行质地剖面分析(texture profile analysis, TPA)。

1.2.8 奶酪抗氧化性的测定

按照所购试剂盒的使用说明进行测定。

1.2.9 数据处理

液相数据采用Empower软件进行分析,其余数据由Excel、SPSS 26.0进行处理,系统发育树由MEGA 11进行构建,柱状图由Origin 2021完成。

2 结果与分析

2.1 红曲霉奶酪感官评价

根据红曲霉的菌落外观、颜色、正反面差别等特征,从红曲腐乳、红曲酒糟中初步分离出15株疑似红曲霉菌株。将这15株自分离菌株与实验室提供的10株红曲霉用于奶酪制备,并进行感官评价。如表3所示,按照构建的感官风味评价体系,对制备的红曲霉奶酪样品进行评分。

表3 红曲霉奶酪感官得分Table 3 Sensory score of Monascus cheese

根据感官得分情况,选取奶酪得分在60分以上的红曲霉菌株进行菌种鉴定及二次筛选,即BC18、BC17、ZX-99、BC20、BC07、X2-2。这6株菌制作的奶酪皆咸鲜适中,滋、气味良好。其中,BC20奶酪在苦味、酸味、气味方面的评分相对较低,这可能是由于菌株发酵能力较强,奶酪的成熟度比其余5款奶酪高而导致的。ZX-99奶酪在鲜味和组织状态的评分相对较低,这可能是由于奶酪的成熟度比其余5款奶酪低,导致风味不足,奶酪质地偏硬。对于这2种情况,后续可通过调整成熟时间、成熟温度或其他工艺优化来进行改善。由气味部分的评分可知,整体气味的得分与霉味、香味的得分呈正相关。说明霉味的存在会破坏奶酪整体的气味,一些奶酪因具有其自身特有的香气而对奶酪整体气味具有较大积极作用。由颜色部分的评分可知,浅色的奶酪外表比深色的奶酪外表更受欢迎,深色外表的奶酪由于彼此之间颜色差异较小而得分接近。

2.2 红曲霉分离鉴定

2.2.1 红曲霉的菌落特征

经感官筛选后,从菌种库菌株及自分离菌株中优选出的红曲霉菌落如图1、图2所示。

a-BC07;b-BC17;c-BC18;d-BC20;e-X2-2;f-ZX-99图1 红曲霉菌落形态图(PDA)Fig.1 Colony morphology of Monascus (PDA)

a-BC07;b-BC17;c-BC18;d-BC20;e-X2-2;f-ZX-99图2 红曲霉菌落形态图(脱脂乳琼脂)Fig.2 Colony morphology of Monascus (skim milk agar)

由图1、图2可知,BC07、BC17、BC18、X2-2的菌落形态较为相似。在PDA平板中菌落呈橘红色,其营养菌丝体密布在营养基质内部,边缘呈不规则花瓣状,气生菌丝较为疏松、丝状交织。在脱脂乳琼脂平板中,菌落呈深红色,表面毛绒状菌丝不明显,菌落边缘趋于圆形。BC20、ZX-99的菌落形态较为相似。在PDA平板中表面呈同心圆状,菌落色泽较浅,BC20的气生菌丝较为密集、丝状交织,ZX-99的气生菌丝较为致密。在脱脂乳琼脂平板中,营养菌丝体为深红色,气生菌丝体为粉白色。以上6株菌的菌落形态与KUMURA等[15]记录的红曲霉属相似,故初步认定其为Monascus。由图2可知,这6株菌在脱脂乳基质中生长状态良好,有望用于奶酪制备。

2.2.2 生物学鉴定

根据EL-DAWY等[16]对分离自柑橘类水果的青霉菌进行系统发育分析的方式进行修改。将2.1节中筛选出的优良风味菌进行DNA测序,于NCBI中挑选序列相似性较高的红曲霉菌株,通过MEGA 11的ClustalW程序进行比对,使用邻接法推断进化历史,进行1 000次相似度重复计算构建发育树[17]。具体如图3所示,上标“T”代表模式菌株,括号内为登录号。根据发育树构建结果,鉴定菌株BC07、BC17、BC18、X2-2、BC20、ZX-99为红曲霉属(Monascus)。结合菌落特征、生物学鉴定以及KUMURA等[15]对于不同红曲霉菌株在乳清蛋白基质上生长情况的记录,初步推测BC07、BC17、BC18、X2-2为紫色红曲霉(Monascuspurpureus),BC20与ZX-99为红色红曲霉(Monascusruber)。

图3 基于DNA序列分析的红曲霉系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Monascus based on DNA sequence analysis

2.3 红曲霉奶酪的安全性分析

将优选出的6株红曲霉菌株用于奶酪制备,在成熟期结束时,对其进行安全性检测,结果如表4所示。

表4 红曲霉奶酪的安全性及功能性物质含量Table 4 Safety and functional substance content of Monascus cheese

桔霉素是一种真菌毒素,常见于曲霉属、青霉属和红曲霉属的代谢产物中,具有遗传毒性、肝毒性和肾毒性等危害[18]。由表4可知,BC20与ZX-99具有较高的安全性,其奶酪样品中桔霉素含量低于国标最低检测限25 μg/kg,远低于国标的定量限80 μg/kg。而BC07、BC17、BC18、X2-2奶酪的桔霉素含量过高,不宜用于制作奶酪。红曲霉代谢产物中含有多种活性成分,其中的洛伐他汀具有降低血脂的功效。γ-氨基丁酸是大脑中的神经递质,其与谷氨酸的相互作用对正常的神经功能至关重要[19]。与其他发酵菌株相比,BC20与ZX-99的功能性代谢产物洛伐他汀及γ-氨基丁酸的含量较高,具有开发生物功能乳制品的潜能。

2.4 红曲霉奶酪的理化分析

按照1.2.3节中所述的工艺进行奶酪的制备,该工艺的特色在于可以解决红曲霉奶酪在成熟过程中容易染菌的问题,成功实现“0染菌”,在此基础上还保证了奶酪的品质、缩短了成熟用时。所制备的奶酪如图4所示,这是一款新开发的上海玫瑰奶酪,按照质地、原料、成熟方式可定义为半软质-牛乳-表面霉菌成熟奶酪。奶酪表皮颜色、状态根据发酵菌株的特性而有所差异。菌株BC07、BC17、BC18、X2-2所制备的奶酪类似,如图4-a所示,奶酪表皮接近樱桃木色(Cherrywood,该颜色的十六进制代码为#631823)。菌株BC20所制备的奶酪如图4-b所示,奶酪表皮接近粉红色(Baby Pink,该颜色的十六进制代码为#f4c2c2)。菌株ZX-99所制备的奶酪如图4-c所示,奶酪表皮接近玫瑰尘色(Rose Dust,该颜色的十六进制代码为#9b5b67)。不同奶酪表皮外观的差异与图2中菌株在脱脂乳琼脂培养基中呈现的菌落形态差异具有一定相关性。奶酪在成熟适度的情况下,内部接近木瓜色(Papaya Whip,该颜色的十六进制代码为#fff0d2),并且质地柔软细腻。

a-BC07、BC17、BC18、X2-2;b-BC20;c-ZX-99图4 红曲霉奶酪Fig.4 Monascus cheese

该工艺下,成熟期结束时奶酪的理化检测结果如表5所示,奶酪的水分含量在(41.45±0.72)%～(45.49±0.67)%,高于XIA等[12]、翁胜男等[20]所制备的红曲干酪在成熟第14天时的水分含量(约35%),根据与李春梅等[21]的工艺对比研究可知,这一现象可能与切割凝乳的大小以及成熟容器有关。奶酪的蛋白质含量在(17.70±0.44)%～(17.99±0.22)%,与焦晶凯等[22]研究中所制备的软质红曲-白霉干酪的含量相当[(17.40±0.14)%～(19.60±0.85)%]。脂肪含量在(32.65±0.77)%～(36.31±0.80)%,这取决于原料乳中脂肪的含量、稀奶油的添加量以及发酵菌株对脂肪的分解程度。奶酪的成熟度可由蛋白质的水解程度来进行判断,pH 4.6可溶性氮通常被用作判断奶酪成熟的指标[23]。在1.2.3节中所述工艺下制备的奶酪,除BC17与ZX-99外,其余奶酪的pH 4.6可溶性氮含量在(32.59±0.98)%～(40.99±0.90)%,与孙颜君等[24]、XIA等[12]所制备的红曲干酪在成熟期结束时的pH 4.6可溶性氮含量相当。通过感官品评与成熟指标的对比可知,在这种工艺下,奶酪只需熟化14 d,即可达到成熟品质,大大缩短了成熟用时,节省了制备成本,为红曲霉奶酪的产业化提供技术参考。

表5 红曲霉奶酪的理化检测 单位:%Table 5 Physicochemical detection of Monascus cheese

2.5 红曲霉奶酪的质构分析

成熟期结束时,奶酪的质构分析如图5所示。由图5-a可知,奶酪ZX-99的硬度显著高于其他5款奶酪,其次是BC17,硬度最低的是BC20。结合2.1节风味品评与2.4节可溶性氮含量,推测奶酪的硬度可能与奶酪熟化程度以及菌株发酵特性有关。熟化程度不够在一定程度上会导致奶酪质地偏硬,成熟适度则奶酪软糯适中,成熟过度则奶酪容易内部流心、整体易塌散。相同制备工艺下,奶酪的硬度与菌株成熟奶酪的能力呈负相关,菌株成熟奶酪能力越强、奶酪中蛋白质水解程度越高、奶酪硬度越小。结合郑远荣等[25]对切达奶酪不同成熟时期的研究,推测这一现象可能是由于不同菌株产酶的情况不同,从而导致蛋白结构和脂肪结构的降解情况存在差异。由图5-b、图5-c可知,奶酪的弹性为0.90～0.93,内聚性为0.35～0.43,组间没有显著差异。郝教敏等[26]、DIEZHANDINO等[27]认为,奶酪的弹性、内聚性与凝乳酶、凝乳时的pH值、Ca+浓度以及谷氨酰胺转胺酶相关。故在同类发酵菌株、相同奶酪制备工艺下,奶酪弹性及内聚性的差异较小。奶酪的咀嚼性的大小由硬度、弹性、内聚性三者的乘积得到[28]。由图5-d可知,奶酪ZX-99由于硬度较高,其咀嚼性也显著高于其他5款奶酪。在品尝过程中,其他5款奶酪与奶酪ZX-99相比,口感更加柔嫩。

a-硬度;b-弹性;c-内聚性;d-咀嚼性图5 红曲霉奶酪的质构参数Fig.5 Texture parameters of Monascus cheese注:组间不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。

2.6 红曲霉奶酪的抗氧化分析

红曲霉在生长代谢的过程中会产生不同种类的酶,如蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等。其中,蛋白酶的产生对奶酪中蛋白质的水解具有一定积极作用,从而丰富奶酪中多肽、短肽、游离氨基酸的种类与数量。在这些水解产物中,存在一些具有抗氧化能力的活性物质。图6展示了不同奶酪在ABTS阳离子自由基体系、DPPH自由基体系以及对铁离子还原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)这3个方面的抗氧化结果。在ABTS阳离子自由基体系中,奶酪BC18、BC20、X2-2表现出的抗氧化能力显著较高,其次是奶酪ZX-99,而奶酪BC17表现的抗氧化能力最低;在FRAP方面,奶酪BC07表现出的抗氧化能力显著较高,而奶酪ZX-99表现的抗氧化能力最低,其次是奶酪BC17。综合ABTS阳离子自由基体系与FRAP这2方面,奶酪BC17、ZX-99表现的抗氧化能力较差,结合2.4节中理化分析结果推测,这可能是奶酪BC17、ZX-99的与其他4款奶酪相比成熟度略低、蛋白质水解程度较低、功能性抗氧化产物较匮乏导致。在DPPH自由基体系中,奶酪BC07表现出的抗氧化能力显著较高,而奶酪BC20、ZX-99表现出的抗氧化能力显著较低。这一结果与奶酪的成熟情况不呈相关性,结合2.2.2节中菌株的系统发育树分析结果,推测这可能是由于不同种的红曲霉在生长代谢的过程中存在一定差异,导致奶酪中抗氧化物质的情况存在差异。

a-ABTS法;b-DPPH法;c-FRAP图6 红曲霉奶酪的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activity of Monascus cheese

3 结论

本文通过直接分离法对红曲腐乳及红曲酒糟中的菌株进行初步筛选,得到15株疑似红曲霉菌株。将这15株来自酒糟的红曲霉及实验室提供的10株来自腐乳的红曲霉以一种新型短熟工艺进行奶酪制备,筛选出具有风味优势的6株,即BC07、BC17、BC18、BC20、X2-2、ZX-99。通过DNA序列比对及进化树分析,鉴定该6株菌为红曲霉属。通过安全性及功能性物质的定量检测,认为BC20与ZX-99在具备风味优势的同时还具有食用安全性。通过理化指标的检测及与其他工艺下理化结果的对比,认为在短熟工艺下,BC20与ZX-99具备熟化奶酪的能力,其中BC20的熟化能力更强。通过质构分析,认为随着奶酪的熟化程度提高,口感会变得更加柔嫩。通过抗氧化性分析,发现奶酪中抗氧化物质在不同检测体系中表现出的抗氧化能力,与奶酪的熟化程度及发酵菌株的特性皆相关。本课题研究是从感官风味出发,在短熟工艺下对源于食品的红曲霉进行筛选,得到BC20与ZX-99两株适宜用于制作奶酪的红曲霉菌株,为改善红曲霉奶酪制作工艺、节约制作成本、进一步研究其特征代谢产物提供参考。