姜黄素通过Keap1-Nrf2通路抑制甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞的增殖、迁移及侵袭

任 丽，邹明远，朱行春，3，徐文隽，3，刘刚，孙俊杰，范方田，张从利

蚌埠医学院1检验医学院，2临床医学院，3癌症转化医学安徽省重点实验室，4药学院//安徽省生化药物工程技术研究中心，安徽 蚌埠 233030；5第一附属医院麻醉科，安徽 蚌埠233004

甲状腺癌（TC）是内分泌系统最常见的肿瘤，约占96%［1］，占所有恶性肿瘤2%。TC发病率增长幅度远超其它恶性肿瘤［1-4］。分化型甲状腺癌（DTC）占TC病理类型的95%［5］。2005～2015年间，DTC发病率增长近5倍［6,7］。甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的DTC病理类型，约占87%［5,8］。新发甲状腺癌中，PTC占92%。部分PTC患者，尤其是复发性PTC患者因缺少有效的治疗方法，远处转移发生率及死亡率逐年升高［2,3,7-9］。近年来，有关PTC发生、发展机制的研究逐步深化、精准，而针对难治性、复发性PTC的小分子活性药物靶向治疗策略成为研究焦点。

由姜科植物提取的小分子化合物—姜黄素，抑制多种肿瘤细胞生长、转移［10-13］，既往研究证实姜黄素抑制B-CPAP人甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移、转移能力的分子机制涉及细胞凋亡［14］、G2/M 期阻滞［15］、TGF-β/Smad2/3通路［16］等途径。姜黄素通过调节核转录因子红系-2-相关因子2（Nrf2）影响A549肺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究已有报道［12,13］。而有关姜黄素对B-CPAP细胞Nrf2的影响及其与细胞迁移、侵袭能力间关系的报道较为少见。

此项研究目的在于验证姜黄素对B-CPAP人甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，探讨其与Nrf2通路间的关系。旨在为甲状腺乳头状癌的治疗提供分子靶点，为临床开发治疗新策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人甲状腺癌细胞B-CPAP（赛库），姜黄素（麦克林），胎牛血清（FBS）（Lonsera），RPMI 1640培养基（Gibco）。ABW 基质胶（上海诺娃），N-乙酰半胱氨酸（NAC）、TRIzol（GLPBIO）、逆转录试剂盒（近岸）、胰酶消化液、RIPA 裂解液(强)、活性氧（ROS）、SDS-PAGE 凝胶及MTT检测试剂盒（碧云天）；transwell小室、培养瓶、培养皿及96孔、6孔板（Corning）；核蛋白提取试剂盒（上海贝博公司）；Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）Rabbit pAb 及二抗（ABclonal），Nrf2 mouse mAb 及二抗（Santa Cruz）。

1.2 细胞培养

B-CPAP细胞接种于培养瓶、培养皿，该株细胞的培养液配方如下：FBS∶PR1640培养基=1∶10。细胞培养2～3 d后、细胞汇合度约80%时，进行传代操作。

1.3 MTT实验

B-CPAP细胞消化后铺96孔板、细胞数约5000/孔，细胞密度约70%时分别加入含姜黄素0、5、10、15、20 µmol/L 的新培养液，相应时点（24、48、72 h）后加MTT溶液、100µL/孔，继续孵育4 h；再加Formazan溶解液、100µL/孔，混匀Formazan溶解液与MTT溶液，37 ℃水浴箱中孵育约3 h，酶标仪检测。

1.4 Transwell迁移实验

接种细胞于Transwell小室、每室约50 000细胞，设姜黄素（0、5、10、15、20µmol/L）组，下室内分别加入相应浓度姜黄素的完全培养基500 μL，24 h后刮去底面未穿过膜的细胞、依次用甲醇及0.1%结晶紫染液处理，各10 min。选取5以上个视野、高倍镜下拍照并计算穿膜细胞的数量。

1.5 Transwell侵袭实验

接种于已包被基质胶（10 mg/mL）Transwell小室中、约5×104/室，余步骤同Transwell迁移实验。

1.6 ROS检测

细胞铺6孔板、约2×105/孔，密度70%时分别加入含姜黄素0、5、10、15、20µmol/L的新培养液。24 h后，按照DCFH-DA 液∶PRIM 1640 培养基=1∶1000 比例配制DCFH-DA稀释液，加稀释液1 mL/孔，培养箱孵育30 min，吸弃稀释液，培养基洗涤细胞、3次/孔；胰酶消化液消化细胞、500 μL/孔，1.5 min后终止消化，转移消化脱落的细胞液至离心管，1000 r/min离心5 min；重悬每管液体后检测。

1.7 Western blot

B-CPAP细胞铺于100 mm×20 mm培养皿中，待细胞密度约70%时换含姜黄素0、5、10、15、20µmol/L的新完全培养基：①24 h 后用刮刀刮至出现浓稠液体、2000 r/min离心15 min后上清部分即为总蛋白；②500g离心5 min，弃上清、PBS清洗2次、加入约300 μL预冷提取液A，混匀、标本放冰盒中继续振荡约20 min，2000g离心5 min后上清部分即为细胞胞浆蛋白。沉淀中加入80～200 μL预冷提取液B、振荡15 s、标本放冰盒中继续振荡30～40 min、12 000g离心10 min，上清部分即为细胞核蛋白。定量及变性待检测蛋白选用BCA法。配分离胶、浓缩胶胶，SDS-PAGE电泳法80 V先电泳约30 min、再120V电泳60～90 min。200 mA转膜2 h。封闭60 min；孵育一抗、二抗，HRP底物显色。图像结果处理应用Image J 软件、灰度值定量分析及绘制柱状图应用Graphpad Prism7软件。

1.8 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

B-CPAP细胞铺在100 mm×20 mm培养皿中，细胞密度约70%时加入含姜黄素（0、5、10、15、20µmol/L）新培养液，继续培养24 h。细胞总RNA应用TRIZOL法制备好后应用逆转录试剂盒转录总RNA，热循环参数为：95 ℃20 s、60 ℃20 s、72 ℃30 s，40 个循环，最终72 ℃再延伸5 min。数据分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=实验组（Ct 目标基因-Ct 内参）-对照组（Ct 目标基因-Ct 内参）。基因、内参的扩增引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.9 统计学处理

应用SPSS 19.0软件分析实验结果，其中计量数据以均数±标准差表示、用Graphpad Prism 7作图；比较实验数据组间差异用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素抑制B-CPAP细胞增殖

不同浓度（0、5、10、15、20 µmol/L）姜黄素作用B-CPAP 细胞24、48、72 h的MTT结果显示：细胞存活率随姜黄素浓度的升高、作用时间的延长显著降低（P＜0.05或P＜0.01，图1）。

图1 姜黄素对B-CPAP细胞增殖的影响Fig. 1 Viability of B-CPAP cells treated with different concentrations(0,5,10,15,and 20 μmol/L)of curcumin for 24,48 and 72 h.*P＜0.05,**P＜0.01 vs 0 μmol/L.

2.2 姜黄素抑制B-CPAP细胞迁移、侵袭

Transwell 迁移实验所示，与0 µmol/L 组细胞比较，B-CPAP细胞迁移数量随姜黄素浓度增加而显著减少（P均＜0.001，图2A、B）；Transwell侵袭实验可见与0µmol/L组细胞比较，穿过小室的B-CPAP细胞数量随姜黄素浓度增加而显著减少（P均＜0.001，图2C、D）。

图2 姜黄素对B-CPAP细胞迁移、侵袭能力影响Fig. 2 Curcumin inhibits migration and invasion of B-CPAP cells.A:Transwell migration assay(Scale bar:100 μm).B: Number of migrated cells.C: Transwell invasion assay (Scale bar: 100 μm).D: Number of invasion cells.***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.3 姜黄素诱导B-CPAP细胞ROS水平升高

姜黄素呈剂量依赖性触发B-CPAP细胞总ROS产生（与0 µmol/L 组细胞比较，P＜0.05 或P＜0.01，图3A）。用5µmol/L抗氧化剂NAC与20µmol/L姜黄素联合作用B-CPAP细胞24 h，发现与姜黄素组细胞比较，NAC联合姜黄素组细胞ROS水平显著降低（P＜0.001，图3B）。

图3 姜黄素对B-CPAP细胞ROS水平影响Fig. 3 Effect of curcumin on ROS level in B-CPAP cells.A:Changes of ROS in B-CPAP cells after treatment with different concentrations of curcumin for 24 h.B:Changes of ROS in B-CPAP cells after treatment with 20 μmol/L curcumin with and without NAC(5 μmol/L)for 24 h.*P＜0.05,**P＜0.01 vs 0 μmol/L;▲P＜0.001 vsCurcumin 20.

2.4 姜黄素对B-CPAP细胞Nrf2、Keap1的影响

2.4.1 姜黄素对B-CPAP 细胞Keap-1 及Nrf2 蛋白、mRNA水平的影响 Western Blot结果所示，与0 μmol/L组细胞比较，10、15、20 μmol/L姜黄素均可诱导Nrf2蛋白表达显著降低、Keap1蛋白水平显著增加（P＜0.05或P＜0.01，图4A、B）。与0 μmol/L组细胞比较，20 μmol/L姜黄素显著降低细胞Nrf2 mRNA 水平（P＜0.05，图4C）、显著升高Keap1 mRNA水平（P＜0.01，图4D）。

图4 姜黄素对B-CPAP细胞Nrf2、Keap1蛋白及mRNA水平的影响Fig. 4 Nrf2 and Keap1 protein expressions in BCPAP cells treated with curcumin.A:Western blots of Nrf2 and Keap1 proteins in BCPAP cells treated with different concentrations of curcumin for 24 h.B:Quantification of the results of Western blotting.C,D:Nrf2 and Keap1 mRNA expressions in BCPAP cells treated with 20 μmol/L curcumin for 24 h detected by qRT-PCR.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.4.2 姜黄素抑制B-CPAP 细胞核Nrf2 活性水平 与0 μmol/L组细胞比较，20 μmol/L姜黄素处理后胞胞核内Nrf2蛋白表达水平显著下降（P＜0.05，图5A、B）、而胞浆内Nrf2蛋白表达量未见显著差异（P＞0.05，图5C、D）。

图5 姜黄素对B-CPAP细胞细胞核、细胞浆Nrf2蛋白水平的影响Fig. 5 Western blotting for detecting Nrf2 protein expressions in the cell nuclei and cytoplasm of B-CPAP cells treated with different concentrations of curcumin for 24 h.A,B:Western blots of nuclear Nrf2 and quantitative analysis of the results.C,D:Western blots of cytoplasmic Nrf2 and quantitative analysis of the results.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

3 讨论

研究认为姜黄素的抗癌作用主要归因于高浓度姜黄素可诱导ROS升高及促氧化，高水平ROS触发细胞下游一系列事件［17］。20 μmol/L姜黄素可通过诱导BGC-823胃癌细胞ROS升高而激活应激信号通路，最终促使细胞凋亡［18］。高浓度姜黄素亦可通过诱导ROS升高而抑制胶质母细胞瘤细胞、结肠癌细胞生长、增殖［18,19］。本研究中，姜黄素在0、5、10、15、20 μmol/L浓度范围内，呈剂量依赖性地抑制B-CPAP细胞增殖、迁移及侵袭能力，剂量依赖性诱导ROS升高、在20 μmol/L时达峰值，并且可被ROS清除剂NAC特异性逆转。而ROS生成和清除失衡可诱发氧化应激损伤。以上结果与既往文献研究结果一致［15,17,18］。进一步验证了姜黄素通过诱导肿瘤细胞ROS升高致细胞发生DNA损伤，而促使肿瘤细胞死亡的结论。

作为抗氧化应激最主要的核转录因子，Nrf2表达不足是ROS清除减弱的重要原因。生理情况下，细胞合成Nrf2的同时亦降解Nrf2。未降解的Nrf2与Keap1结合为复合物，以非活性状态存在于胞质中。而氧化应激情况下，Keap1构象变化和/或Nrf2磷酸化，活化的Nrf2与Keap1解偶联、易位至细胞核，先后与Maf蛋白、抗氧化反应原件结合，诱导下游抗氧化，解毒基因转录、表达，提高细胞抗氧化应激能力［20-22］。Nrf2作为机体抗氧化应激的重要因子，主要受Keap1 调控，二者组成Keap1-Nrf2通路。肿瘤细胞高度活跃的增殖、分裂状态致使细胞内ROS升高，进而诱发细胞氧化损伤。而Nrf2可通过降低ROS水平而减轻其介导的细胞凋亡。Nrf2过度激活增强肿瘤细胞增殖能力、代谢水平、凋亡抗性及侵袭能力［23-25］。正常情况下，Nrf2的激活可提高细胞对癌变的防御能力。而在肿瘤诱导条件下，Nrf2无限异常激活，可保护肿瘤细胞免于氧化应激损伤、诱发放疗抵抗［26］，降低化疗药物敏感性［27］。而姜黄素可增强耐药肿瘤细胞的药物敏感性，与化疗药物联用时可提高化疗药物的作用［12-14］。姜黄素可通过抑制Nrf2 降低A549细胞、MCF-7细胞增殖、迁移及侵袭能力。受此启发，为进一步验证姜黄素抑制甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制，我们应用Western Blot法验证姜黄素剂量依赖性升高细胞总蛋白Keap-1水平、降低Nrf2水平，本研究更有意义的发现是姜黄素主要通过降低Nrf2水平及活性而降低B-CPAP细胞抗氧化应激能力，诱导ROS升高。我们推测姜黄素对BCPAP细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制与Keap1-Nrf2通路有关。

多项研究表明Keap1-Nrf2通路在肿瘤发生、发展中具促癌、防癌的双重作用，是一把“双刃剑”。肿瘤发生的初始阶段，Nrf2通过其Neh2结构域结合Keap1的Kelch结构域而泛素化、Nrf2的降解可促进癌症发生；肿瘤的发展阶段，Nrf2的激活突变及Keap1的功能突变破坏二者的结合状态、Nrf2被过度激活，增加肿瘤细胞增殖、转移能力，甚至影响细胞自噬、铁死亡、代谢重编程等情况［28］。肿瘤组织中Nrf2亦常见过表达，且肿瘤组织Nrf2高表达与不良临床结果及预后显著相关［29,30］。Nrf2在肿瘤发生、发展及治疗中的双重作用使Nrf2靶点及相关通路成为研究热点。抑制Nrf2为癌症药物研发提供了新的靶点。Nrf2抑制剂可通过增加化疗药物作用敏感型而提高临床肿瘤放、化疗治疗效果。最近有关Nrf2抑制剂治疗、预防癌症的临床及基础研究一定程度证实抑制Nrf2在肿瘤治疗中的潜在价值。本研究亦证实姜黄素可通过降低甲状腺乳头状癌B-CPAP 细胞Nrf2含量及活性而抑制细胞增殖、迁移及侵袭。与既往研究中姜黄素可通过降低Nrf2抑制肺癌、乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭研究结论一致［12,13］。但是，Nrf2抑制剂的临床治疗效果及适用性需要进一步的研究［31,32］。而本研究亦缺少患者甲状腺乳头状癌标本Nrf2蛋白水平检测及Nrf2抑制剂治疗的研究。

有关Nrf2激活、失活分子机制的研究亦成为癌症研究的新方向。Keap1-Nrf2信号通路是目前Nrf2研究的焦点，目的是探索该通路在癌症、甚至其他以氧化还原稳态改变为特征疾病中的潜在价值。综上，本研究初步证实姜黄素抑制甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞增殖、迁移及侵袭能力，具体机制可能与姜黄素通过抑制Nrf2活性调控Keap1-Nrf2通路有关。此项研究将为临床开发姜黄素治疗甲状腺乳头状癌的新策略提供潜在靶向分子以及理论基础。