肺泡一氧化氮在间质性肺疾病诊断及鉴别中的应用价值

常潇丹，陈美佳，廖画，董航明，蔡绍曦

南方医科大学1南方医院呼吸与危重症医学科，2护理学院，广东 广州510515

间质性肺疾病（ILD）是一类主要累及肺间质和肺泡腔、导致肺泡-毛细血管功能单位丧失的弥漫性肺疾病，发病隐匿，且早期无特异性临床表现，其主要结局是气体交换障碍，导致呼吸困难、运动耐受性降低从而影响生活质量［1］。其发病机制较为复杂，大多数ILD的特征是炎症或纤维化，或是两者的组合，需要全面的病史资料、放射学及病理信息来鉴别和诊断，目前胸部高分辨率CT（HRCT）是关键的检查手段，特别是在疾病的早期，在超过66%的ILD患者中，利用HRCT结合临床表现足以对其做出诊断［2］。结缔组织病（CTD）是一组多系统、多器官受累的自身免疫性疾病，肺是CTD并发症的常见发生部位，肺部受累可表现为多种方式，其中ILD最为多见，CTD相关ILD（CTD-ILD）见于如系统性硬化病（SSc）、类风湿关节炎（RA）、多发性肌炎（PM）/皮肌炎（DM）和干燥综合征（SS）等多种CTD中［3］，临床表现为隐匿进展或急剧加重时，患者肺功能恶化，显著影响预后，甚至危及生命［4］。原发CTD 病种不一，目前CTD-ILD尚无公认的诊断标准，同时不同ILD的异质性使得ILD的准确识别和诊断面临挑战性，某些情况下还需支气管肺泡灌洗等操作来辅助诊断，积极探索简单无创的筛查方法及便于疾病鉴别的生物标志物是非常有意义的。

一氧化氮（NO）作为血管扩张剂、支气管扩张剂和炎症介质发挥作用，由一氧化氮酶家族（NOSs）生成，根据功能和发现的部位，NOS分三种亚型［5］，神经型一氧化氮合成酶（nNOS），内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合成酶（iNOS），前两者为构成型，iNOS在炎症、免疫激活等条件下经诱导产生NO，主要来源于气道上皮细胞、内皮细胞及常驻巨噬细胞等［6］，在呼出的气体中可检测到。有研究发现通过iNOS产生过多的NO与肺部亚硝酸盐-氧化应激相关，并促进ILD小鼠模型的异常纤维化过程［7］。eNO分析仪可以对NO浓度进行检测，目前呼出气一氧化氮（FeNO）已广泛运用于哮喘的诊疗和疾病管理，发挥着重要的临床价值。多流速NO检测能够相对区分支气管和肺泡来源的NO，肺泡一氧化氮（CaNO）通过双室模型计算得出［8］，目前已有研究探索其在哮喘、慢性阻塞性肺病及闭塞性细支气管炎等疾病中的临床运用［9-14］。研究发现CaNO值反映了自身免疫性肺泡蛋白增多症中的肺泡炎症［15］，SSc患者合并ILD时CaNO明显高于单纯SSc患者，提示CaNO在ILD中有潜在的应用价值［16］。本研究通过比较ILD患者和健康人eNO参数的差异，以及ILD中CTD-ILD患者和非CTD-ILD患者eNO参数的差异，并分析eNO与其他肺功能指标的相关性，探究eNO在初步诊断ILD及鉴别CTD-ILD和非CTD-ILD中的应用价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择2021年11月～2022年10月在南方医科大学南方医院呼吸与危重症医学科肺功能室就诊的ILD患者。纳入标准：HRCT出现网格状、蜂窝状、磨玻璃影、牵引性支气管扩张或支气管膨大等肺间质病变影像学表现［15］，经影像科及呼吸科医师共同判定；完成肺通气功能检查，表现为限制性通气功能障碍和（或）弥散功能障碍；完成多流速eNO检测。排除标准：确诊支气管哮喘或合并有哮喘的患者；社区获得性肺炎、肺结核患者；eNO检测时过去4周内有过敏性鼻炎发作史；eNO检测时过去4周内有全身糖皮质激素或吸入性糖皮质激素者。选取健康者为对照组，既往无哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张症等慢性呼吸系统疾病病史，测试时不合并呼吸道感染性疾病。

本研究以CaNO作为主要评价指标，利用PASS15对研究中所需样本量进行计算，运用预实验的研究结果，独立样本t检验差异分析μ1=6.38±3.12，μ2=3.85±1.45，取R=1.5，α=0.05（双侧），β=0.10，计算样本量为N1=34例，ILD组至少需要被试者34名；N2=52例，健康组至少需要被试者52名。本研究ILD组纳入被试者45名，健康组纳入被试者68名。

收集并分析入组患者人口统计学和临床数据，包括年龄、性别、BMI、吸烟史、肺功能检测结果和eNO测量结果，在本研究中CaNO结果小于1时记作1ppb。本研究已通过南方医院伦理委员会的伦理批准[编号NFEC-2021-397]。

1.2 检测方法

多流速eNO检测：严格按照2005年ATS/ERS技术标准［16］以及2017年ERS呼气标志物测定技术标准［6］，使用Sunvou医疗电子公司纳库仑一氧化氮分析仪，患者在专业人员指导下进行eNO检测，仪器分析完成后自动生成测试报告，如受试者呼气期间出现漏气、换气、憋气或喷出口水的情况，立即终止测试，待受试者恢复静息状态后，重新进行测试。FeNO是一个与呼气流速相关的指标，流速越小则越能反映大气道中NO浓度水平，反之流速越高则越能反映小气道中的NO浓度水平，在呼气流速为50 mL/s和200 mL/s时分别检测eNO浓度，记作FeNO50、FeNO200，CaNO根据上述FeNO测量得到的数据，通过“two-compartment model”（双室模型）由仪器计算后得出，代表肺泡NO浓度。检测前1 h受试者不得饮食、抽烟、剧烈运动或进行肺功能试验，检测前3 h内不得食用西兰花、芥蓝、生菜、莴苣、芹菜、水萝卜以及熏或腌制类食品。肺功能检测：根据ATS/ERS标准记录由德国Jaeger公司的肺功能仪检测的结果，第1秒用力呼气容积占其预计值的百分比（FEV1%pre），用力呼气容积占其预计值的百分比（FVC%pre），第1秒用力呼气容积占用力呼气容积的百分比（FEV1/FVC），肺一氧化碳弥散量占预计值的百分比（DLCO%pred），用力呼出50%肺活量时的平均呼气流速（MEF50），最大呼气中期流量（MMEF），以及用力呼出75%肺活量时的平均呼气流速（MEF25）。

1.3 分析指标

比较健康组与ILD组及ILD亚组间eNO差异；分析发生ILD的有效预测指标；分析ILD组eNO与肺功能指标的相关性，探讨CaNO在评估ILD患者肺功能损伤中的作用。

1.4 统计学分析

采用SPSS26.0软件进行统计分析，计量资料中符合正态分布的以均数±标准差描述，不符合正态分布的用中位数（第一四分位数，第三四分位数）描述；计数资料以频数或百分比表示。两组正态分布计量资料组间比较采用两独立样本t检验，非正态分布计量资料两样本比较采用Mann-WhitneyU检验。多组计数资料比较采用Pearson χ2检验。预测指标分析采用二元logistic回归进行分析。采用ROC分析并计算AUC探讨CaNO指标用于诊断ILD的价值以及鉴别CTD-ILD的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ILD组与健康对照组患者一般资料比较

共纳入45例ILD患者，其中男性25例，女性20例，患者年龄为55.25±13.88岁，其中有吸烟史者17例，无吸烟史者28例，其中特发性的间质性肺炎（IIP）11例；纳入68名健康者，男性32名，女性36名，年龄为51.44±8.34岁，其中有吸烟史者40名，无吸烟史者28名。各组间年龄、性别、吸烟史、BMI一般人口学资料差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。eNO指标比较，ILD组患者的CaNO、FeNO50、FeNO200的水平均高于健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 eNO参数FeNO50、FeNO200和CaNO在健康组（n=68）和ILD组（n=45）中的比较Fig. 1 Comparison of eNO levels between healthy control subjects(n=68)and ILD patients(n=45).*P＜0.05.

表1 健康组和间质肺组一般资料Tab.1 Baseline characteristics of patients with interstitial lung disease and healthy control sujects

2.2 分析发生ILD的有效预测指标

根据单因素二元Logistic回归分析（表2），FeNO50、FeNO200和CaNO在鉴别健康者和ILD中具有统计学意义。进行共线性诊断后结果显示，变量间存在多重共线性。通过Logistic 逐步回归法进行修正，结果显示FeNO200升高（OR=1.2，95%CI：1.042～1.382）、CaNO升高（OR=1.570，95%CI：1.235～1.996），诊断ILD的可能性越大（表3）。根据回归分析构建的预测模型进行ROC曲线分析，结果显示鉴别健康者和ILD的AUC为0.829（95%CI为0.752～0.906，P＜0.001），提示该模型具有良好的预测价值（图2）。敏感性为82.2%，特异性为54.3%。

图2 基于Logistic回归模型的ROC曲线Fig. 2 ROC curve based on the logistic regression model.

表2 ILD组和健康组基于一般资料和eNO指标的单因素二元Logistic回归分析Tab.2 Univariate binary logistic regression in ILD group and healthy control group based on general clinical data and eNO indicators

表3 ILD组和健康组基于一般资料和eNO指标的多因素二元Logistic回归分析Tab.3 Multivariate binary logistic regression in ILD group and healthy control group based on general information and eNO indicators

2.3 ILD患者肺功能参数与eNO相关性分析

在ILD患者中，39例患者完成肺弥散功能检测，散点图提示ILD组DLCO%pred值与FeNO50水平之间无相关性(r=0.068，P＞0.05)，而DLCO%pred 值与CaNO水平散点图提示两者有线性关系，呈负相关（r=-0.471，P＜0.05，图3）。以小气道有无障碍（MEF50、MMEF、MEF25实际值/预计值，三者中任意两个＜65%）分组，小气道功能障碍组（n=21）FeNO50、CaNO 分别为19.38±8.9 ppb、5.65±3.34 ppb，小气道功能无障碍组（n=24）FeNO50、CaNO分别为21.08±7.9 ppb、5.06±2.04 ppb，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 ILD患者中CaNO与DLCO%pred相关性分析Fig. 3 Correlation analysis between CaNO and DLCO%pred in ILD patients.

2.4 在ILD患者中，CTD-ILD组与非CTD-ILD组比较

CTD-ILD组中18例患者（包括干燥综合症3例，皮肌炎8例，系统性硬皮病3例，类风湿性关节炎2例，混合性结缔组织病2例），男性11例，女性7例，患者年龄为52.33±2.63岁；纳入27例非CTD-ILD患者，男性11例，女性16例，平均年龄为57.20±2.95岁。两组间年龄、性别、BMI等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性（表4）。eNO指标比较，CTD-ILD组患者的CaNO的水平高于非CTD-ILD组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。

图4 eNO参数FeNO50、FeNO200和CaNO在CTD-ILD组（n=18）和非CTD-ILD组（n=27）的比较Fig. 4 Comparison of eNO levels between CTD-ILD patients(n=18)and non-CTD-ILD(n=27).

表4 CTD-ILD组和非CTD-ILD组一般资料和肺功能比较Tab.4 Comparison of general information and pulmonary function between CTD-ILD and non-CTDILD groups

2.5 CaNO鉴别CTD-ILD和ILD的敏感度和特异度

CTD-ILD患者CaNO水平高于非CTD-ILD患者，CaNO 鉴别CTD-ILD 和非CTD-ILD 的AUC 为0.725[95%CI为0.576～0.875，P=0.011]，其最佳临界值为6.65 ppb，鉴别CTD-ILD 和非CTD-ILD 的敏感性为50%，特异性为81.6%（图5）。

图5 CaNO鉴别CTD-ILD分型和非CTD-ILD分型的ROC曲线Fig. 5 ROC curve of CaNO for differential diagnosis between CTD-ILD and non-CTD-ILD.

3 讨论

本研究分析比较了ILD患者与健康人的eNO参数，及CaNO作为ILD严重程度及小气道功能评估标志物的可能性，并探索了CTD-ILD患者与非CTD-ILD患者的eNO参数和肺功能指标的特点，评价了eNO这种无创、可重复性高的检测技术在ILD中的潜在应用价值。

本研究的目的是确定eNO参数在ILD诊断中的潜在作用，结果显示ILD 患者在FeNO 流速为50 mL/s、200 mL/s 的值以及CaNO值，均高于健康对照组。Logistic回归结果显示FeNO200联合CaNO对ILD的初步诊断有较好的价值。Cameli等［20］在健康者与特发性肺纤维化（IPF）患者中比较流速50 mL/s、100 mL/s和150 mL/s时eNO的水平，结果显示IPF患者eNO结果高于健康者。本研究首次使用国产仪器常规设置的50mL/s、200 mL/s流速观察ILD患者eNO水平，结果与上述研究一致。此学者在另一项研究中验证CaNO用于IPF疾病预后的价值，生存分析结果显示，CaNO≥6 ppb的患者预后显著较差［21］。NO被认为是上皮细胞伤口愈合和修复过程中的一个关键介质，原因是参与这些机制的成纤维细胞、上皮细胞和炎症细胞等在被激活时能够通过不同的途径产生NO［22,23］。有研究报道NO直接参与肺纤维化，证明博莱霉素诱导的肺纤维化模型的支气管肺泡灌洗液中硝酸盐和亚硝酸盐的产生增加，与iNOS的显著过表达相关［24］。ILD患者CaNO水平高于健康人，可能与在肺纤维化受累阶段iNOS被激活，促进NO产生，进一步加强了肺部炎症和纤维生成有关［25］。在一项对COVID-19感染出院后3个月患者的研究中，发现肺部CT存在磨玻璃结节的患者CaNO值更高，其次是CT提示有纤维化改变的患者，这可能也提示NO参与肺纤维化的发生［26］。目前NO在肺纤维化发生过程中的作用及机制仍存在争议，需要更多的研究探索其如何影响肺纤维化的发生发展。

值得注意的是，当分析eNO参数与肺弥散功能的关系时，本研究发现，CaNO与DLCO%pred水平呈负相关关系，有研究［21］在IPF患者中发现CaNO与肺一氧化氮弥散因子相关。DLCO%pred不仅是评估肺弥散能力的指标，也是评估ILD预后重要的指标之一。有研究表明［10］，CaNO有作为反映NO通过肺泡毛细血管膜扩散功能标志物的潜在功能，由于肺泡毛细血管膜增厚而导致的进行性损害减少了肺泡腔中NO的排出，导致NO潴留，可能与肺部损害程度成正比，也有学者［27］研究结果表明肺泡内NO生成的增加严重影响肺泡扩散功能，从而促进肺泡进行性损害。CaNO和肺弥散功能之间的相关性提示CaNO可能作为反应肺泡弥散功能的潜在标志物，在ILD患者病情严重程度评估中发挥作用，在临床中eNO检测与肺功能检查联合使用有助于医生更好的判断ILD患者的肺功能情况。越来越多的研究［11,28,29］开始关注NO在小气道中的应用，有结果提示CaNO是反映外周小气道炎症的敏感指标，同时有研究发现CaNO升高可能提示小气道障碍。我们的研究在ILD患者中以小气道有无障碍分组，未发现小气道功能障碍组CaNO值高于小气道功能无障碍组，可能因为不同研究间疾病构成的异质性，后续需要更大样本量研究探索CaNO是否可以灵敏的反应ILD患者的小气道功能。

本研究的另一个目的是分析在ILD中，CaNO区别CTD-ILD和非CTD-ILD的潜在价值。此前已有研究探索FeNO在鉴别不同亚型的ILD之间是否具有价值，结果发现FeNO可作为鉴别慢性过敏性肺炎与其他类型肺纤维化的工具［30］。在SSc合并ILD和未合并ILD的患者中探索CANO的应用，结果发现CANO是诊断SSc患者ILD的一个潜在生物标志物，与HRCT联合评估可以发挥更好的效果［31］。本研究在探究CaNO的鉴别价值中发现，与其他ILD相比，CTD-ILD患者的CaNO水平更高，这一发现可能与这些CTD中发生更明显的炎症过程刺激了肺组织中iNOS的异常过表达有关［32］，这提示CaNO可能可作为鉴别CTD-ILD和非CTD-ILD的工具。许多ILD患者具有自身免疫性的临床表现或血清学特征，但没有达到CTD的明确诊断，或报告肺纤维化是CTD 的第一表现。因此，探索新的工具鉴别CTD-ILD与非CTD-ILD患者是至关重要的。

本研究首次探索了在国内人群中eNO检测对ILD的潜在诊断作用，但仍存在一定的局限性，样本量较小，为回顾性的单中心研究，结果可能存在偏倚，希望未来能够进行大样本的多中心前瞻性研究，进一步探索验证CaNO在ILD患者鉴别诊断中的作用，以期将CaNO广泛应用于ILD患者的鉴别诊断以及肺功能损伤严重程度、小气道功能的评价。

综上所述，CaNO的作用可能不止于辅助ILD的诊断，在鉴别CTD-ILD、评估肺部损伤程度上也具有较大的潜在应用价值，且多流速检测联合使用具有较为理想的诊断价值。eNO检测具有可重复性、操作简单等优点，有助于疾病管理，值得在临床实践中研究和推广。