OBSCN突变对于肝癌细胞增殖和迁移能力的影响

付琳琳 王 玉 赵雪梅

1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 泰安 271016；2. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）临床与基础医学院，山东 济南 250117

细胞骨架蛋白Obscurin（由OBSCN编码的蛋白）[1］是细胞内的分子支架，广泛分布于横纹肌、脑、肝、脾和肺等多种组织细胞[2］。有研究表明，OBSCN基因在乳腺癌和结直肠癌中表现了高度突变[3-4］。在乳腺癌患者样本中也观察到OBSCN基因突变率超过了15%[5］。原发性肝癌是我国目前发病率高、危害性大的恶性肿瘤之一[6-7］，临床有效治疗手段缺失[8-9］。本研究以人肝癌细胞HepG2为模型，构建过表达对照空载体HepG2 GL119细胞系、OBSCN过表达HepG2 H21157 细胞系、敲除对照空载体HepG2 ecas 细胞系和OBSCN敲除HepG2 OBSCN KO 细胞系，初步探究OBSCN突变对于肝癌细胞增殖和迁移能力的影响，为进一步探究OBSCN基因在肝癌发生发展中所起到的作用奠定了基础，为改善肝癌预后不良的现状提供了新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞HepG2、MEM 培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司），NonEssentialAmino、丙酮酸钠（美国GIBCO 公司），DMEM 培养基、胰蛋白酶消化液（山东思科捷生物技术有限公司），Polybrene（美国Sigma 公司），过表达对照病毒GL119（pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE）、目 的 病 毒H21157[pSLenti-CMV-OBSCN（3 250 ~ 4 749bp，G1333R）-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE］（上海和元生物技术有限公司），DNA 引物合成与克隆质粒的序列测定（上海生工生物工程技术服务有限公司），BsmBI-v2（美国NEB 公司），Lipofectamine™ 2000 转染试剂（美国invitrogen 公司），嘌呤霉素（Solarbio），rTag PCR Mix、DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司），OBSCN 抗体（Sigma），CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），transwell小室（美国康宁公司）。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR 实验所用细胞均为处于对数生长期细胞，于37℃，5% CO2培养箱中培养，完全培养基配比为DMEM/MEM 培养基∶FBS 胎牛血清∶青链霉素= 9∶1∶0.1，细胞铺板前使用台盼蓝染液进行细胞计数。提取细胞RNA，反转录得到cDNA，设计合成引物（表1）。荧光定量PCR（qPCR）混悬体系上机检测，验证OBSCN有无本底表达。

1.2.2 慢病毒滴度测定与慢病毒感染 取处于对数生长期的HepG2细胞，在24孔板中以2.5 × 105/孔的浓度接种，将慢病毒H21157进行梯度稀释，共做3 个梯度，即每孔含10、1、0.1 μL 病毒，加至接种好细胞的24 孔板中，感染12～20 h 后，更换新鲜培养基。感染72 h 后收集细胞并进行慢病毒滴度的测定。

慢病毒滴度测定公式为慢病毒滴度（IU/mL） =（C × N × D × 1 000）/V，其中：V = 加入的稀释病毒的体积数，C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数，N = 感染时细胞的数目，D = 病毒载体的稀释倍数。

将HepG2 细胞以4 × 105/孔的浓度接种于6 孔板，12～20 h 后感染病毒，每孔加10 μg polybrene。感染12～20 h后弃去培养基，每孔加入2 mL新鲜的培养基。72 h后加入终浓度为2 μg/mL puromycin 的新鲜培养基。每隔2～3 天换1 次终浓度为2 μg/mL puromycin 的新鲜培养基，筛选2 周后，扩大培养，得到OBSCN 过表达细胞系，其中空载体对照HepG2 GL119稳转细胞系感染的病毒载体为HepG2-pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE，OBSCN过 表达HepG2 H21157 稳转细胞系感染的病毒载体为：HepG2-pSLenti-CMV-OBSCN（3 250 ~ 4 749 bp，G1333R）-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE。

1.2.3 引导RNA的设计 以人类基因组全序列数据库的数据（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）和Crispr Cas9 慢病毒质粒LentiCRISPR v2 中U6 启动子的转录偏好要求，选取染色体序列中原始OBSCN的外显子位点（3 951 ~ 3 972 位），设计包含BsmBI核酸内切酶酶切产生的粘性末端对应序列的引导RNA（guiding RNA， gRNA）正反引物OBSCN-exon gsRNAF 和OBSCN-exon gsRNAR，见表2。同时参照载体LentiCRISPR v2 的全序列，设计针对两BsmBI 酶切位点上下游2 160 bp 的鉴定引物BsmBI ID F和BsmBI ID R，见表2。

表2 引导RNA和鉴定引物序列

1.2.4 构建重组质粒reOBSCN 将含引物OBSCN-exon gsRNAF/R 的聚合酶链式反应（PCR）反应管按照37℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃/min降温至25℃的反应条件运行退火反应。PCR退火反应结束后，使用0.8%的琼脂糖凝胶板进行电泳分离。

经UV瞬时照射、切取目的条带进行纯化回收，回收产物定量后，按照100 ng经BsmBI酶切线性化的载体质粒LentiCRISPR v2、1 μL 1∶10 稀释后的上一步反应液、5 μL 10XNEBuffer、2 μL BsmBI、5 μL ATP、5 μg BSA、2.14 μL T4 DNA Ligase和ddH2O，将反应液补足至50 μL的反应体系配制连接反应液；在充分混匀后，按照37℃ 5 min，20℃ 5 min，循环1～20 次；80℃ 20 min循环21次反应条件进行连接反应。待反应管充分冷却后，将其转移至-20℃冷冻保存。

取5 μL连接反应液，按分子克隆[10］建议的方案转化DH5α感受态细菌，涂布含氨苄青霉素的LB固体平板培养后，转移至37℃温箱培养16～24 h 后，取出平板培养基观察、标记优势抗性生长的单菌落。用无菌的10 μL枪头依次轻缓地挑取各优势抗性生长的单菌落，分别转移至含引物BsmBI ID F 和BsmBI ID R 的PCR 反应液中，其中细菌的体积按0 μL计，进行PCR扩增[11］和电泳检测。

1.2.5 质粒提取与鉴定 用无菌枪头挑取PCR初步筛选阳性的单菌落，转移至分装有6 mL含氨苄青霉素LB 培养基的试管中，在37℃温浴摇床震荡培养16 h。取1 mL菌液送检测序；同时将剩余菌液用无内素质粒提取试剂盒提取质粒。质粒溶液经Nanophotometer 测定浓度及纯度后，取1 μg 转移至含引物BsmBI ID F和BsmBI ID R的PCR反应液中，进行PCR扩增和电泳检测。

1.2.6 puromysin 筛选浓度的测定 配置0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 μg/mL 共6 个 浓 度 梯 度 的puromysin 溶液处理细胞48 h，拍照，根据细胞形态变化，确定puromysin细胞处理浓度。

1.2.7 质粒转染与有限稀释法建立OBSCN敲除突变的单细胞克隆 培养细胞融合度达50%左右时，使用无内毒素质粒reOBSCN和lipo 2000试剂转染，在转染之前使细胞在饥饿状态下培养，4 μL reOBSCN 和200 μL 空白培养基室温平衡5 min，含lipo 2000（混合比例为50∶1）的培养基室温平衡5 min，二者混合后平衡20 min，转染4 h后更换含血清正常培养基，培养6 h，更换含puromysin 的培养基，转染48 h后，更换含血清正常培养基，细胞成团生长后，采用有限稀释法进行单细胞克隆铺板，培养4 h后取出96孔板，标记出只有1个细胞的孔，第4天和第8天对单细胞孔进行换液处理，11～13天，对优势生长细胞株消化传代，扩大培养，得到敲除对照空载体HepG2 ecas 稳转细胞系和OBSCN敲除HepG2 OBSCN KO稳转细胞系。

1.2.8 Western blot蛋白免疫印迹实验 提取细胞蛋白，经BCA 定量后，电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF 膜上，恒压法转膜，10%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，一抗4℃ 56 r/min 在摇床上孵育12～16 h，TBST 洗液洗涤3 次，二抗室温孵育1～2 h，TBST 洗液洗涤3次，ECL发光液显影。

1.2.9 CCK-8 法检测细胞增殖能力 取处于对数生长期的细胞，以5 000个/孔的细胞浓度接种于96孔板上，每组重复3次，每24 h进行CCK-8检测。连续检测6 d。

1.2.10 Transwell 实验检测细胞迁移能力 取处于对数生长期的细胞，使用不含血清的DMEM培养基重悬细胞，取1 × 105/200 μL 接种于上室，并在下室加入500 μL 完全培养基，72 h 后取出小室，PBS洗涤3次后，用预冷甲醇固定半小时，棉签轻轻擦去上室细胞，每擦1 次用PBS 洗涤1 次，用DAPI 染液染色后清洗、拍照并计数。

1.3 统计学分析

分析数据均用均数 ± 标准差来表示，组间的比较采用student-t检验，统计分析以及绘图均采用GraphPad Prism 8.4.3 统计软件进行。检验水准为α= 0.05。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR 验证HepG2 细胞有无OBSCN本底表达

采用荧光定量PCR 技术验证HepG2 细胞有无OBSCN本底表达，根据定量数值及分析（表3）、GAPDH 内参溶解曲线（图1A）和OBSCN目的基因溶解曲线（图1B），可以得知HepG2 细胞无OBSCN本底表达。

图1 荧光定量PCR验证HepG2细胞有无OBSCN本底表达

表3 HepG2细胞qPCR定量数值及分析

2.2 慢病毒滴度测定结果

针对病毒载体pSLenti-CMV-OBSCN（3 250 ~4 749 bp， G1333R）-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE，进行慢病毒滴度测定，得到H21157 病毒原液滴度为5.66 × 108（IU/mL）。

2.3 慢病毒感染HepG2 细胞构建OBSCN 过表达细胞系

按照表4 所示病毒量感染细胞，慢病毒感染HepG2细胞72 h后，对HepG2（Blank）、HepG2 GL119、HepG2 H21157细胞拍照（图2A），可以看到慢病毒感染复数MOI为20时HepG2细胞状态良好；慢病毒感染HepG2 细 胞，puromysin 筛 选14 d 后，对HepG2 GL119、HepG2 H21157细胞拍照（图2B），可以看到使用puromysin筛选14 d后HepG2细胞状态良好。

图2 慢病毒感染HepG2细胞形态（× 100）

表4 不同滴度对应的病毒量

2.4 重组质粒reOBSCN的PCR鉴定结果

为验证重组质粒是否已经构建成功，利用普通PCR 扩增及琼脂糖电泳的方法验证扩增片段的大小是否与预期一致，质粒PCR琼脂糖电泳结果中泳道1～3分别为Marker、空载体对照质粒和reOBSCN重组质粒，可以看到泳道3 在308 bp 处有条带，2 000 bp 处无条带（图3A），证明reOBSCN 构建成功，菌落PCR 琼脂糖电泳结果中泳道1～3 分别为Marker、对照空载体PCR 反应液和reOBSCN 重组质粒菌落PCR 反应液，可以看到泳道3 也就是reOBSCN重组质粒菌落的PCR反应液在308 bp处有明显条带（图3B），进一步证明reOBSCN构建成功。

图3 琼脂糖电泳结果

2.5 重组质粒reOBSCN的测序结果

对上述已经验证条带大小正确的含重组质粒菌液测序，对所得到的正向序列测序结果（图4A）和反向序列测序结果（图4B）进行分析比较，进一步验证重组质粒reOBSCN是否构建成功，正向和反向序列测序结果均显示reOBSCN 与设计的引导RNA 引物序列（小写斜体加粗标记）一致，证明重组质粒reOBSCN构建成功。

图4 reOBSCN重组质粒双向测序结果

2.6 HepG2细胞饥饿状态及puromysin筛选浓度

为探究血清对HepG2细胞形态的影响，对细胞进行了24 h 内饥饿状态的探究（图5A），分别于0、4、8、10、20、24 h拍照，最终确定每次实验前对细胞进行4 h 饥饿状态处理，以消除血清对后续实验的干扰。为探究HepG2 细胞的puromysin 抗性浓度，对细胞进行了puromysin 抗性筛选（图5B），采用含0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 μg/mL的puromysin培养液处理细胞48 h，拍照，根据细胞形态变化，最终确定0.75 μg/mL 用 做 后 续 实 验 中HepG2 细 胞 的puromysin处理浓度。

图5 HepG2细胞形态（× 100）

2.7 Western blot 蛋白免疫印迹实验检测Obscurin蛋白表达量

在蛋白表达水平上观察5株细胞Obscurin蛋白表达含量变化（图6）。构建的4株细胞系和HepG2细胞中目的蛋白Obscurin与内参蛋白Tubulin的比值，其中HepG2 细胞中Obscurin/Tubulin = 4.06，HepG2 H21157过表达细胞株中Obscurin/Tubulin = 6.98，相较于HepG2 GL119 过表达空载对照细胞株中Obscurin/Tubulin = 4.03，OBSCN蛋白表达水平明显升高，进一步证明OBSCN过表达载体构建成功；而HepG2 ecas 敲除空载对照细胞株中Obscurin/Tubulin = 6.69，相较于HepG2 OBSCN KO 敲除细胞株中Obscurin/Tubulin = 1.98，OBSCN蛋白表达水平降低，说明成功构建了OBSCN敲除表达载体。

图6 Western blot检测Obscurin蛋白表达量

2.8 CCK-8法检测细胞增殖能力

为探究OBSCN过表达及敲除细胞系对细胞增殖的影响，通过CCK-8法绘制细胞增殖曲线，第6天后细胞均到达平台期，故取前6 天的检测结果绘制细胞增殖曲线。第6 天可以明显看出HepG2 H21157 稳定表达细胞系相较于HepG2 GL119 稳定表达细胞系增殖加快（图7A），差异有统计学意义（P< 0.000 1），说明OBSCN过表达加快HepG2肝癌细胞的增殖；而HepG2 ecas 稳定表达细胞系与HepG2 OBSCN KO 稳定表达细胞系相比，HepG2 OBSCN KO 稳定表达细胞系增殖减慢（图7B），差异有统计学意义（P< 0.000 1），由此可以说明OBSCN的敲除会减慢HepG2肝癌细胞的增殖。

图7 CCK-8法检测HepG2细胞增殖能力

2.9 Transwell法检测细胞迁移能力

利用Transwell 小室法，检测OBSCN突变对HepG2肝癌细胞迁移能力的影响。HepG2 H21157与HepG2 GL119相比，72 h迁移细胞数见表5，可以看出HepG2 H21157 稳定表达的细胞系迁移细胞数为150.30 ± 14.95，HepG2 GL119 迁移细胞数为136.50± 15.02，可知OBSCN过表达使HepG2肝癌细胞迁移加快（图8 A）；而HepG2 ecas 与HepG2 OBSCN KO 相比，72 h迁移细胞数见表5，HepG2 ecas迁移细胞量为147.80 ± 11.55，HepG2 OBSCN KO 迁移细胞量为112.70 ± 20.30，差异有统计学意义（P< 0.01），可知OBSCN的敲除会减慢HepG2 肝癌细胞的迁移（图8B）。

图8 Transwell法检测HepG2迁移能力（DAPI染色，× 200）

表5 不同细胞72 h迁移细胞数

3 讨 论

2020年全球癌症负担数据显示，因肝癌死亡的人超过83万[12］。但其发生发展机制尚不明确，总体预后不良。而细胞骨架蛋白OBSCN是体细胞突变频率较高的基因，位于lq42，跨越170 kb，并受到其119个外显子的选择性剪接，产生多种转录本，从而得到一个分子量跨度极大的蛋白质族群，基因序列长，功能区复杂[13］。

OBSCN主要存在于脊椎动物横纹肌组织中，在肌原纤维形成过程中发挥多种作用，包括提供整体结构完整性和肌原纤维稳定性，更具体地说是提供例如肌球蛋白等相关蛋白的适当空间定位[14］。有研究表明，通过对突变频率在肝癌样本中大于5%的TP53、TTN、CTNNB1、MUC16、PCLO、RYR2、OBSCN等45 个关键致病基因作为预后因素，进行生存分析和单因素cox 比例风险模型分析，单因素cox比例风险模型分析显示OBSCN与预后有显著相关性，且在生存分析中也被认为对预后有显著影响[15］。根据OBSCN在横纹肌和乳腺上皮细胞内发挥的支持骨架和信号传递的作用，推测其对维持肝癌细胞组织和促进信号转导有关键性作用，进而可以缓解肝癌患者的不良预后。

本研究利用荧光定量PCR 技术确定HepG2 肝癌细胞无OBSCN本底表达，利用慢病毒感染的方法，成功构建OBSCN过表达稳定表达细胞系，Crispr Cas9 技术构建OBSCN敲除重组质粒reOBSCN，随后经菌落PCR、质粒PCR 以及基因测序均验证其构建成功，将reOBSCN转染进HepG2细胞中，从而得到OBSCN敲除稳定表达细胞系，蛋白免疫印迹实验验证敲除及过表达细胞系构建成功。通过CCK-8法、transwell小室实验验证得知，OBSCN过表达会加快HepG2 肝癌细胞的增殖和迁移，而OBSCN基因的敲除则会减慢HepG2 肝癌细胞的增殖和迁移。

综上所述，OBSCN基因突变可以影响肝癌细胞的增殖和迁移，在肝癌的发生发展中起到了重要作用。本研究成功构建了OBSCN突变的稳定表达细胞系，为进一步深入探究OBSCN突变对肝癌细胞的生物学调控作用奠定了基础。研究以期寻找可行的药物作用靶点，从而为肝癌的不良预后现状提供理论支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突