恒温扩增法在下呼吸道感染病原体检测中的价值

杨晓娟

(咸宁市咸安区温泉社区卫生服务中心,湖北 咸宁 437000)

下呼吸道感染(lower respiratory tract infection,LRTI)是指发生于支气管、肺部的病原体感染[1],其症状包括咳嗽、咳痰、胸痛、发热等,严重者会引起呼吸困难,甚至危及生命[2]。LRTI的病原体种类繁多,包括细菌、病毒、真菌等,不同的病原体导致的感染症状和治疗方法也不同[3]。因此,在LRTI的诊断和治疗中,病原体检测具有重要的临床意义。传统的LRTI病原体检测方法主要包括细菌培养、血清学检测和分子生物学检测等。然而,这些方法存在检测时间长、准确率低、成本高等问题,且对于病原体的种类和数量有一定的限制,难以满足临床的实际需求[4-6]。因此,需要寻找一种快速、准确、灵敏的下呼吸道感染病原体检测方法。恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法是一种新型的核酸扩增技术,与传统病原体检测方法相比,具有操作简便、准确率高、成本低等优点,因此,在医学检测、环境监测和食品安全等领域得到了广泛的应用[7-8]。其基本原理是在恒温条件下,利用酶的特异性催化作用,使特定DNA序列反复扩增,从而检测出病原体。本研究旨在探究LAMP法在LRTI病原体检测中的应用价值,为临床LRTI的病原体检测提供更多的选择。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2022年1月至2022年8月我院255例LRTI患者的痰液或肺泡灌洗液,应用LAMP法和痰培养法检测13种常见病原体。255例LRTI患者中男177例,女78例。年龄分组根据世界卫生组织(WHO)2016年年龄分类标准[9]:少年组(≤17岁)13例;中青年组(18～59岁)88例;老年组(≥60岁)154例。痰合格标准:涂片行革兰染色,低倍镜视野(low power-field,LP)下多形核白细胞>25/LP,鳞状上皮细胞<10/LP。肺泡灌洗液合格标准:鳞状上皮细胞比例小于1%。纳入标准:符合中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)诊断标准[10];接受同时进行LAMP法及痰培养法病原学检测;检测前未使用抗生素;入院前未使用免疫抑制剂。排除标准:有其他基础疾病,长期使用激素及其他免疫抑制剂;不能配合样本采集者。本研究已获得我院伦理委员会批准,患者自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪、晶芯呼吸道病原菌核酸检测(LAMP法)试剂盒购自博奥生物集团有限公司。VITEK®2 COMPACT全自动细菌鉴定仪、血平板、麦康凯培养基(法国生物梅里埃股份有限公司)。革兰染色试剂、抗酸染色试剂购于珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LAMP法病原体检测

于清晨采集患者3～5mL痰液或肺泡灌洗液(空腹),向分泌物标本中加入等体积的10%NaOH,充分振荡混匀,37℃液化30min,提取DNA备用。取34.5μL样本DNA与20μL恒温扩增试剂混匀,加入芯片,离心30s。应用RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪47min扩增检测,对应软件分析检测结果。

1.3.2 痰培养

收集合格痰标本进行常规痰培养,参照《全国临床检验操作规程》[11]进行检测。痰标本接种于血平板、加万古霉素巧克力平板、罗氏培养基,置于35℃、5%CO2潮湿环境中培养;接种于麦康凯平板,需置于35℃普通环境培养。一般细菌培养24～48h,结核分枝杆菌培养1～4周,观察培养基并筛选病原体进行鉴定。

1.4 观察指标

①对比LAMP法与痰培养法对LRTI病原体检测结果的差异性和一致性。Kappa一致性检验评价检测;Kappa<0.2说明一致性程度较差;0.2～0.4说明一致性程度一般;0.4～0.6说明一致性程度中等;0.6～0.8说明一致性程度较强;0.8～1.0说明一致性程度很强。②通过LAMP法研究苛养菌及不典型病原体在感染群体中是否存在性别和年龄差异。

1.5 统计学方法

使用SPSS 24.0软件分析。计数资料以百分比和例数表示,行χ2检验;使用Kappa一致性检验进行一致性评价。P<0.05说明差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种方法检测病原体阳性率

LAMP法检出阳性率为78.43%(200/255),病原体以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为主,其次为肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌。痰培养法检出阳性率为31.37%(80/255),病原体以肺炎克雷伯菌为主,其次为铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌。LAMP法总阳性率显著高于痰培养法(P<0.05)。见图1。

图1 两种方法病原体检测阳性率比较

2.2 两种方法检测结果的一致性分析

两种检测方法对肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌及苛养菌(肺炎链球菌、流感嗜血杆菌)的一致性程度中等。见表1。

表1 两种方法检测结果的一致性分析

2.3 病原体与感染者性别的关系(LAMP法)

苛养菌在感染群体中无性别差异,肺炎克雷伯杆菌在感染群体中男性感染率高于女性(P<0.05)。见表2。

表2 病原体与感染者性别的关系(LAMP法)

2.4 病原体与感染者年龄的关系(LAMP法)

苛养菌在感染群体中无年龄差异,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在老年组中感染率高(P<0.05),肺炎支原体在少年组中感染率高(P<0.05)。见表3。

表3 病原体与感染者年龄的关系(LAMP法)

3 讨 论

LRTI广泛存在于全球范围内,对人类的健康造成了严重威胁[12],因此,及时准确地检测和诊断LRTI病原体对于治疗和预防LRTI至关重要。LAMP法是一种新兴的核酸扩增技术,具有操作简单、无需昂贵的仪器设备、成本低廉、快速灵敏等优点,在临床检测中具有广阔的应用前景。LAMP是于2000年研发出的一种恒温核酸扩增方法,其原理是针对靶基因上6个不同区域设计4种特异性引物,利用链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)下保温30～60min,即可完成核酸扩增反应[13]。与常规PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程[14]。与痰培养法相比,大幅度缩减了检测时间[15]。

虽然分离培养法是诊断LRTI的金标准,但LAMP法可以从微量拷贝中获取靶基因,具有很高的敏感度,如果以培养法作为金标准,很有可能会造成LAMP法检测为阳性的患者,被判定为假阳性,降低LAMP法的特异性。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为例,本研究中LAMP法的阳性率超过45%,而培养法未能检测出该病原体。因此,为了评价结果的准确性,本研究并没有采用敏感度和特异度表示,而是直接对比了LAMP法与痰培养法对各种病原体的检出率。结果发现,LAMP法总阳性率显著高于痰培养法。齐晓丽等[16]对383例疑似下呼吸道感染患者的痰液标本进行了LAMP芯片法和痰培养法检测,LAMP芯片法检测出92例病原体阳性,痰培养法检测出30例阳性,LAMP芯片法阳性率(24.02%)高于痰培养法(7.83%)。刘佳佳等[17]分析了155例重症监护病房肺部感染患者的合格痰标本,以LAMP法检出125例阳性,阳性率为80.6%,痰培养法检出108例阳性,阳性率为69.8%,LAMP法的阳性率高于痰培养法。

苛养菌是一大类对生长环境、营养要求较苛刻的细菌,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌就属于苛养菌,一般从送检到接种时间不能超过30min,分离培养阳性率低,所需时间长,滞后于病情发展。为进一步比较LAMP法与痰培养法对LRTI病原体检测的差异,本研究还对两种方法检测结果的一致性进行了分析,结果显示,两种检测方法对肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌及苛养菌的一致性程度较好,说明LAMP法能够在较短的时间内,准确地检测出苛养菌。LAMP法对LAMP病原体检测阳性率高可能是因为LAMP可以从微量拷贝中获取靶基因,敏感度高;部分病原体,如苛养菌,所需培养条件较高,分离培养需要专业的培养基和技术人员,培养技术要求较高,故培养阳性率低。

本研究采用LAMP法对255例LRTI患者的痰液或肺泡灌洗液进行检测,结果发现,LAMP法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检出率最高,其次为肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌,但对大肠埃希氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎支原体的检出率不足10%。王咏红等[18]对230例LRTI患儿的分泌物样本进行LAMP法检测,病原体检出率从高到低依次为耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌,对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌的检出率不足10%。魏晓楠等[19]应用LAMP法对0～97岁2029例LRTI患者的痰标本进行检测,检出病原体以流感嗜血杆菌为主,其次为肺炎链球菌以及肺炎支原体,鲍曼不动杆菌、嗜肺军团菌、结核分支杆菌复合群、肺炎衣原体阳性率均较低。考虑到这可能与感染人群的性别和年龄有关。

本研究将255例LRTI患者分别根据性别和年龄进行分组,研究LRTI病原体在感染人群中的分布特点,结果显示,苛养菌在感染群体中无性别和年龄差异,但肺炎克雷伯杆菌在感染群体中男性感染率高于女性,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在老年组中感染率高,肺炎支原体在少年组中感染率高,说明不典型病原体在感染人群中存在性别和年龄差异。研究结果有助于进一步探索影响病原体感染的因素,帮助临床合理地选择抗生素。

综上所述,LAMP法在LRTI病原体检测中具有优越的检测性能,操作简单、成本低、检测时间短、检测阳性率高,尤其是对苛养菌进行快速检测,适用于医疗资源不足的地区,或需要快速诊断的紧急情况。