人磷酸丙糖异构酶在大肠埃希菌中的表达、纯化及鉴定*

刘 洁,金科华

(1.湖北科技学院医学部公共卫生与健康学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院医学部基础医学院生物化学教研室)

人磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TPI)是由两条相同肽链构成的同二聚体。TPI是糖酵解途径的重要酶之一,催化磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛之间的相互转化,只有将前者转化为后者后,糖酵解才能完成,并防止磷酸二羟丙酮的积累[1]。TPI在肺癌、泌尿系统肿瘤中高表达[2-3]。激活TPI加速糖酵解和ATP生成,抑制TPI则导致磷酸二羟丙酮转向磷酸戊糖途径[4]。

TPI的功能因细胞而异。依托泊苷处理宫颈癌HeLa细胞后,TPI被Cyclina/CDK2磷酸化而失活,糖酵解和ATP生成受阻[5],导致细胞凋亡。在多重耐药性胃癌细胞SGC-7901/VCR中,TPI表达水平低于不耐药的细胞,过表达TPI的细胞则可以部分逆转其对化疗药物的抗性,提高化疗效果。可见,TPI的抑制剂或激活剂可能会控制不同肿瘤细胞的生长[6-7]。为此本研究拟通过基因工程,在大肠埃希菌中表达TPI,为后续筛选其活性调节剂和功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

大肠埃希菌DH5α(货号:CD201-01)、BL21(DE3)(货号:CD601-02)感受态细胞购自北京全式金生物技术公司;pET-28a质粒为笔者保存;TPI cDNA由厦门大学韩家淮院士惠赠;胶回收试剂盒(货号:B518131-0050)和IPTG(货号:A600168-0005)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。200bp DNA ladder(货号:3423A )、Supercoiled DNA Ladder Marker(货号:3585A)、Taq DNA聚合酶(货号:R001A)、DNA连接酶试剂盒(货号:6022Q)购自大连宝生物工程有限公司;限制性内切酶NdeI和XhoI(货号分别为R0111S和R0146S)购自美国NEB公司;His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)(货号:CW0894S)购自康为世纪生物科技有限公司;截留分子量10kd超滤管(货号:UFC9010)购自Merck Millipore公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:BL521A)购自Biosharp公司;兔抗人TPI多克隆抗体(货号:ab96696)购自英国Abcam公司;His-Tag兔单克隆抗体(货号:12698)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)(货号:7074)购自Cell Signaling公司。

1.2 PCR扩增TPI编码序列(coding sequence,CDS)

设计扩增TPI CDS正向引物Pf;5′-GACCA-TATGATGGCGCCCTCCAGGAAG-3′,反向引物Pr;5′-ATCCTCGAGTCATTGTTTGGCATTGATGATG-3′。斜体序列依次为NdeⅠ、XhoⅠ位点。PCR体系:H2O 41.5μL,10×Taq DNA聚合酶Buffer 5μL,dNTP Mixture、Pf(10μmol/L)、Pr(10μmol/L)各1μL,TPI cDNA 1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR参数:95℃ 3min;94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 1min,30个循环;72℃延伸5min。取2μL PCR产物进行电泳检测,剩余PCR产物按胶回收试剂盒回收。

1.3 PCR产物、质粒的酶切与回收

PCR产物酶切:TPI PCR产物15μL,10×Cutsmart Buffer 5μL,H2O 16μL,NdeⅠ、XhoⅠ各2μL,37℃酶切1h。质粒酶切:pET-28a 8μL,H2O 40μL,10×Cutsmart Buffer 6μL,NdeⅠ和XhoⅠ各3μL,37℃酶切3h。按试剂盒回收酶切的PCR产物和质粒。

1.4 PCR产物与pET-28a的连接、转化

取1.3酶切的pET-28a和酶切后纯化的PCR产物各2.5μL(摩尔比1∶4)、DNA连接试剂盒之Solution I 5μL,混匀,16℃连接3h。取5μL连接产物,热激法转化DH5α感受态细胞,于50μg/mL卡那霉素的LB平板(下称抗性平板)筛选抗性菌落。

1.5 重组质粒的鉴定

随机选取两个抗性菌落,分别接种于4mL含50μg/mL卡那霉素的LB(下称抗性LB)中,于摇床上37℃ 250r/min培养过夜,按质粒抽提试剂盒提取质粒,记为pT1、pT2。酶切鉴定:pT1(或pT2)5μL,10×CutSmart buffer 2μL,H2O 11μL,NdeⅠ、XhoⅠ各1μL,混匀,37℃反应30min。酶切产物进行电泳检测,将阳性质粒委托华大基因公司测序。

1.6 TPI的表达

取重组质粒pT1 5ng,热激法转化BL21(DE3)感受态细胞,于抗性平板筛选重组菌落。挑一个抗性菌落,记为BL21(DE3)-pT1,接种于3mL抗性LB中,37℃ 250r/min培养过夜,作原液。次日,将1mL原液加入100mL抗性LB中,37℃培养至A600约0.9,加入终浓度0.1mmol/L的IPTG,37℃ 250r/min培养4h。收集菌液,于4℃12 000r/min离心2min,弃上清,加10mL PBS洗涤沉淀一次,室温12 000r/min离心2min,弃PBS,加10mL细菌蛋白裂解液和终浓度1mmol/L的PMSF重悬沉淀。以200W功率按工作5s停5s的程序,冰浴超声1h。4℃12 000r/min离心10min。取120μL上清,加4×Loading Buffer 40μL,混匀,99℃加热10min,取10μL进行SDS-PAGE检测。剩余上清用于纯化TPI。

1.7 TPI的纯化

向层析柱中加1mL Ni2+层析珠,流尽保存液,用10mL超纯水清洗。将9mL裂解液上清与9mL结合缓冲液混匀后加入层析柱,于4℃旋转混匀15min,流出未结合的蛋白,分别用含20、40、80mmol/L咪唑的洗涤液40mL,依次洗涤层析柱,去除非特异性结合的蛋白。加10mL含200mmol/L咪唑的洗脱液洗脱TPI。取洗脱液120μL,4×Loading Buffer 40μL,混匀,99℃加热10min,室温13 000r/min离心5min,取上清备用。将洗脱液用截留分子量10kD的超滤管超滤浓缩至约1mL,向超滤管加入9mL pH7.4的50mmol/L Tris-HCl,混匀,继续超滤浓缩至1mL,重复浓缩-更换缓冲液10次,将洗脱缓冲液更换为pH7.4的50mmol/L Tris-HCl。取少量浓缩的蛋白,用PBS稀释10倍,按BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。取0.9mL超滤后的洗脱液,加终浓度50%甘油和1mmol/L的PMSF,混匀,小份分装,-20℃保存备用。

1.8 TPI的Western blot检测

取变性蛋白样品5μL,SDS-PAGE分离。湿法120V电转1h,将蛋白印迹至PVDF膜。用5%BSA室温慢摇封闭PVDF膜2h。将PVDF膜转入稀释5000倍的抗TPI抗体,4℃慢摇孵育过夜。TBST洗涤PVDF膜3次,每次10min。加入1∶5000稀释的二抗,室温孵育1h,TBST洗涤6次,每次5min。将增强型化学发光液覆盖PVDF膜,于ChemiDoc XRS+成像仪曝光显影。

2 结 果

2.1 TPI cDNA的PCR扩增

TPI cDNA的PCR扩增产物鉴定结果见图1。由图可知,TPI cDNA扩增产物略小于800bp,与TPI CDS分子量(750bp)相符,表明PCR扩增成功。

M:200 bp DNA ladder;1:TPI cDNA PCR产物;2:阴性对照PCR产物

2.2 重组质粒的鉴定

酶切鉴定。重组质粒pT1、pT2的NdeI+XhoI酶切鉴定结果如图2所示。其酶切产生的小片段略小于800bp,与TPI CDS分子量一致,大片段与pET-28a空质粒酶切片段相符。可见,PCR产物插入pET-28a质粒中。

1:pET-28a Nde I+Xho I酶切产物;2:DL15 000 DNA marker;3、4:分别为pT1和pT2 Nde I+Xho I酶切产物;5:200bp DNA ladder

测序鉴定。测序结果如图3A(5端部分测序峰图)和图3B(3端部分测序峰图)所示,图3A中红色下划线部分为NdeI酶切位点,蓝色部分是起始密码子对应的编码序列(ATG),箭头指示mRNA翻译方向;图3B中的蓝色虚线部分为终止密码对应的编码序列(TGA),红色虚线部分为XhoI位点。取NdeI和XhoI之间的序列,用NCBI网站的Blast功能进行比对。Blast结果显示,插入pET-28a的序列与Genbank公布的人TPI CDS(NM_000365.6)序列一致,读码框正确。

图3A pET-28a-TPI 5端测序峰

图3B pET-28a-TPI 3端测序峰

上述鉴定结果表明TPI CDS序列正确插入pET-28a质粒中。

2.3 表达产物的鉴定及浓度测定

TPI CDS插入pET-28a质粒的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,重组TPI(recombinant TPI,rTPI)比原始TPI多29个由载体翻译产生的额外的氨基酸,这部分氨基酸序列的分子量约3.4 kD,TPI分子量约27 kD,故rTPI分子量约30.4 kD。由图4可见,未经IPTG诱导的BL21-pT-1裂解液上清中未出现30 kD左右的强条带;IPTG诱导后出现约30 kD的强条带,与rTPI分子量相符。裂解液上清纯化后,获得分子量约30 kD的高丰度条带。经Image J分析,其纯度为90%。

M:protein marker;1:BL21(DE3)-pT1未经IPTG诱导的裂解液上清;2:BL21(DE3)-pT1经0.1mmol/L IPTG诱导的裂解液上清;3:纯化的rTPI

Western blot结果如图5。抗TPI的抗体鉴定结果显示,未经IPTG诱导的BL21-pT1出现淡条带;IPTG诱导后BL21-pT1及其纯化的产物均出现约30kD的高丰度条带,且均与rTPI分子量相符。抗His-Tag鉴定结果显示未经IPTG诱导的BL21-pT1未出现约30kD的条带;IPTG诱导后BL21-pT1及其纯化的产物均出现约30kD的浓条带,且均与rTPI分子量相符。

M:protein marker;1:BL21(DE3)-pT1未经IPTG诱导后裂解液上清;2、3:分别为纯化前、后的rTPI

浓缩的rTPI浓度为30μg/μL。由此可知,浓缩后的rTPI总量为30mg,rTPI的表达量为300mg/L。

3 讨 论

TPI活性位点的氨基酸残基为Asn11、Lys13、His95和Glu167。Roland等[8]发现Arg189对维持TPI活性中心的盐桥结构非常关键,当其突变为Gln后,TPI活性下降,并且降解加快,从而引起神经功能缺失。糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸是TPI的内源性竞争性抑制剂,反馈抑制糖酵解途径[4]。天然的β-咔啉(β-carboline)类化合物强烈抑制TPI活性,引起神经毒性[9]。Lone等[10]研究表明miR-22和miR-28可以与TPI mRNA的3′非翻译区结合,抑制直肠结肠癌HCT116细胞内TPI的翻译,降低其蛋白水平,抑制糖酵解和乳酸产生,抑制HCT116细胞生长。因基因突变,在三阴性的乳腺癌细胞内的TPI第16位和72位的中心的天冬酰胺(Asn,N)单突变或双突变为酸性的天冬氨酸(Asp,D)后(简称为脱酰胺TPI),空间结构改变。药物雷贝拉唑(rabeprazole)和金诺芬(auranofin)通过非竞争性方式显著抑制脱酰胺TPI活性,而正常细胞内未突变的TPI因与雷贝拉唑和金诺芬亲和力低,不易被抑制,从而使单突变的TPI(N16D)和TPI(N72D)以及双突变的TPI(N16D/N72D)成为三阴性乳腺癌的药物靶点,雷贝拉唑和金诺芬通过抑制脱酰胺TPI,阻断磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate,DHAP)转化为3-磷酸甘油醛,导致DHAP转化为甲基丙二醛和高级的糖基化终末产物,诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡[11]。TPI在其它肿瘤细胞内是否存在其它修饰形式,可用于开发药物靶点值得研究。

抗TPI的抗体鉴定未经IPTG诱导的BL21(DE3)-pT1也出现条带,可能有两种原因,一是BL21(DE3)内源TPI与抗人TPI的抗体发生交叉反应,二是rTPI本底水平表达。而抗His-Tag的抗体检测时,未经IPTG诱导的BL21(DE3)-pT1未出现与TPI分子量相近的条带,说明rTPI本底水平表达很低,可忽略不计。TPI广泛存在于生物界,且序列上存在较高的保守型,故推测未经IPTG诱导BL21(DE3)-pT1固有的TPI可与抗人TPI的抗体反应,而内源的TPI不含有连续的6×His的序列,故抗His-tag抗体不与之反应。

综上所述,TPI功能多样,通过基因工程表达和纯化TPI,研究其结构和功能,筛选其调节剂具有重要意义。