马钱子碱抑制骨肉瘤的作用机制*

董 兰,赵冰洁,曾凤娇,徐智达,刘 洋,王攀琦,宁志丰**

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院医学部基础医学院;3.咸宁市徐健民中医综合诊所)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是儿童及青少年常见的原发性恶性骨肿瘤[1],好发于长骨的干骺端,尤其多见于股骨远端及胫骨近端的位置[2]。最初的症状常表现为局部肿胀和疼痛,不易被发现和重视,易发生肺转移,缺乏有效的治疗靶点且对化疗不敏感,从而引起高致残率和死亡率,预后差。目前,骨肉瘤的治疗主要以手术和化疗为主。但是,即使规范的使用新辅助化疗[3],骨肉瘤的预后仍不能令人满意。近30年来骨肉瘤临床疗效未有显著提升。因此,急需开发新的药物来满足临床需求,为骨肉瘤的治疗提供新的思路。

马钱子碱(Brucine)是一种弱碱性吲哚生物碱,提取自马钱子的种子,主要用于缓解疼痛、关节炎和创伤性疼痛等[4]。已有研究表明马钱子碱在各种类型的癌症中具有抗肿瘤活性,包括结肠腺癌[5]、肝细胞癌[6]、乳腺癌[7]、神经胶质瘤[8]和多发性骨髓瘤[9]等。马钱子碱在肿瘤中可以通过抑制血管生成、下调HIF-1基因的表达等抑制肿瘤的生长增殖,但马钱子碱对骨肉瘤的抗肿瘤作用还未见报道。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/AKT)信号通路在许多癌症中被调控,参与癌症生存、增殖、生长、代谢、血管生成和转移。PI3K/AKT通路受多种上游信号蛋白的调控,它通过与各种代偿信号通路协同调控许多下游效应因子[10]。PI3K/AKT信号通路被认为是人类癌症中最重要的致癌途径之一[11],其中1类与肿瘤的关系最密切,PI3K/AKT信号通路主要作用是促进细胞增殖,抑制凋亡。

本研究中,我们探究了马钱子碱对于人骨肉瘤细胞的体外抗肿瘤作用。为马钱子碱在临床上治疗骨肉瘤提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人骨肉瘤细胞HOS和143B购买自中国科学院细胞库,RPMI Medium Modified培养基(HyClone)和MEM(ATCC改良)培养基(普诺赛公司),胎牛血清(Gibco公司),胰酶(Biosharp生物公司),Transwell小室(Corning生物公司),二甲基亚砜(DMSO,Sigma公司),基质胶(Corning生物公司),DEPC水(Sigma公司),Cell cycle staining Kit、Annexin VAPC/PI apoptosis kit(Multi science上海生物公司),一抗稀释液(中国碧云天生物公司),GAPDH、PI3K、AKT、MMP9、CyclinD1、C-caspase9 (ABclonal公司),马钱子碱购置于四川精粹天成药物科技有限公司(HPLC检测纯度在98%以上)。BeyoClickTMEdU-488细胞增殖检测试剂盒购置中国碧云天生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将骨肉瘤HOS和143B细胞株分别培养在含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的MEM培养基和1640培养基中,置于温度37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,取对数生长期生长状态良好的细胞进行实验。所有实验重复3次。

1.2.2 细胞增殖能力检测

取对数生长期的HOS和143B细胞,以接种浓度6000个/孔接种在96孔板中,每组设置6个平行复孔。恒温培养箱培育至每孔达到90%密度,换液后加入经DMSO溶解后的浓度分别为0、4、8、16、32、64、128、256、512μmol/L的马钱子碱药物处理24h、48h和72h,然后每孔加入0.5%MTT溶液10μL,用锡纸避光继续培养4h,弃去上清,加入150μL/孔的DMSO溶液置于摇床上震荡30min,使用酶标仪于560nm测量吸光度值并分析数据。

取对数生长期的HOS和143B细胞,在24孔板里培养细胞使其生长至所需密度后使用马钱子碱药物处理细胞24h,用事先准备好的EDU添加到对照组和实验组细胞中孵育2～4h,然后使用中性多聚甲醛室温下固定15min,然后PBS洗涤3遍,室温下使用预先配制好的通透液通透20min,然后加入配制好的click-iT反应液室温避光孵育30min,洗涤液洗涤后加入hochest33342进行细胞核染色,然后在显微镜下拍照观察并记录。

1.2.3 细胞划痕实验

收集对数生长期的HOS和143B细胞,调整浓度为1×106个/孔接种在6孔板中,待细胞密度生长至80%～90%后进行划痕实验,PBS溶液清洗1～2次,更换为含有200μmol/L马钱子碱的培养液2mL/孔,于培养箱培养0、24h后分别拍取相应时间点的照片。

1.2.4 平板克隆实验

收集对数生长期的HOS和143B骨肉瘤细胞,浓度为1000个/孔,接种在6孔板中,置于细胞培养箱培养24h后,显微镜下观察细胞呈贴壁且生长良好的单个细胞时,加入含有200μmol/L马钱子碱的培养液,在培养箱中继续培养10d左右,期间2～3d更换一次培养基,镜下观察到细胞长成单个细胞群时即可终止培养。之后用PBS清洗细胞2～3遍,用预冷的甲醛固定20min,然后用0.1%的结晶紫染色20min,用清水洗去多余的结晶紫,最后在显微镜下观察并计数。然后运用公式计算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.5 Transwell侵袭实验

收集对数生长期的HOS和143B细胞,饥饿6h后,上室加入基质胶,浓度为3×105个/孔接种在Transwell小室上室,在Transwell下室分别加入含马钱子碱浓度200μmol/L含20%FBS的MEM高糖培养基和1640培养基,放置于24孔板中,常规培养24h。培养结束后,取出小室,弃去培养基,擦去上室基质胶及未穿膜的细胞,甲醇固定后用0.1%结晶紫染色,晾干后拍照并计数。

1.2.6 流式细胞技术

收集对数生长期的HOS和143B细胞均匀接种在6孔板中,密度为2×106个/mL,待细胞贴壁后用浓度为200μmol/L的马钱子碱处理24h,处理24h后,弃掉上清,用胰酶消化后收获细胞,用冷PBS洗涤两次,然后使用联科细胞周期试剂盒里面的结合液500μL及10μL碘化丙啶染色液染色孵育15～30min后使用流式细胞仪分析样品,上机时采用低速进行流式分析以免对细胞造成损伤影响实验结果。上机完的实验数据使用Modifit进行分析并作图。细胞凋亡同上述所说,按照上述周期操作方法收集好细胞后使用PBS清洗两遍。加入碧云天凋亡试剂盒中的195μL Binding Buffer结合液和5μL FITC标记的Annexin V(10μg/mL),室温避光15min,再加入PI(50μg/mL)10μL,避光反应5min,最后进行上机操作。用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,独立3次上述实验后分析数据。

1.2.7 生物信息预测

本研究中,我们引入了生物信息学预测药物用于疾病模型的方法来寻找机制通路。我们将活性成分输入到PubChem(https://PubChem.NCBI.NLM.NIH.gov/,是一个公共资料库,能够提供关于化学物质及其生物活动的信息)中,得到马钱子碱的2D分子结构文件。然后我们将2D分子结构文件导入如下几个数据库:SwissTargetPredic数据库(http://www.SwissTargetPrediction.ch/)、比较毒理基因组学数据库(http://ctdbase.org/)和UniProt数据库(https://www.UniProt.org/UniProt/)。因此,在丢弃重复数据后,我们收集了与马钱子碱相关的不同目标基因。以骨肉瘤为关键词,通过以下电子数据库对OS相关基因进行检索筛选:基因卡数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、dInet数据库(https://www.dInet.org/home/)。合并数据库搜索结果,删除重复目标,得到骨肉瘤所有目标基因。将马钱子碱有效成分的靶点预测结果与骨肉瘤相关靶点的检索结果进行匹配,选择重叠靶点作为骨肉瘤治疗OS的相关靶点。Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具用于绘制马钱子碱的活性成分目标和疾病目标,并绘制Venn图。然后收集马钱子碱与骨肉瘤的交叉靶点作为马钱子碱治疗OS的共同基因,这可能是马钱子碱治疗OS的潜在靶点集。STRING数据库(https://string-db.org/)收集了大量蛋白质相互作用,并包含一系列数据置信度(低置信度:<0.4;中等置信度:0.4～0.7;高置信度:>0.7)。在此基础上,将马钱子碱和OS的共同基因靶标导入STRING数据库,寻找潜在的候选靶标。基于Web的基因集分析工具包(http://www.webgestalt.org/option.PHP)使用KEGG富集进一步分析潜在的候选靶标,可以彻底了解感兴趣基因的功能和途径富集信息,进而明确马钱子碱治疗骨肉瘤的具体分子机制。

1.2.8 Western blot检测

收集对数期的HOS和143B细胞,加200μmol/L马钱子碱处理24h后,提取骨肉瘤细胞蛋白,进行BCA蛋白定量,加入5×loading Buffer于99.9℃水中煮沸10min后进行蛋白电泳,一抗4℃孵育过夜,二抗常温孵育1h,于蛋白成像系统中曝光,分析结果。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 马钱子碱抑制骨肉瘤HOS和143B细胞增殖

MTT实验检测不同浓度马钱子碱处理143B和HOS骨肉瘤细胞的细胞活性图(图1A、C)以及他们对应的IC50值(图1B、D),发现马钱子碱能够以时间和剂量依赖的方式来抑制骨肉瘤细胞的增殖,EDU增殖实验也证明马钱子碱能够抑制骨肉瘤细胞的增殖(图1F、G),克隆形成实验发现处理组能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖(图1H-K)。结果证明马钱子碱处理以剂量和时间依赖性方式显著抑制了HOS和143B骨肉瘤细胞的增殖。差异具有统计学意义(P<0.01),并具有剂量依赖性。

A、C:不同浓度马钱子碱处理143B和HOS细胞的细胞活性图;B、D:不同浓度马钱子碱处理143B和HOS细胞对应的IC50值图;F、G:200umol/l马钱子碱处理143B和HOS细胞的Hochest和EDU染色效果图;H、J:马钱子碱作用于143B和HOS细胞的克隆形成图;I、K:马钱子碱作用于143B和HOS细胞的克隆形成率统计图(将未给药的细胞作为对照组,其细胞活性和克隆形成率为100%,与对照组相比,*P<0.001,n=3)

2.2 马钱子碱抑制骨肉瘤HOS和143B细胞的迁移

划痕实验检测马钱子碱处理143B和HOS骨肉瘤细胞的细胞横向迁移能力图(图2A、C),以及伤口闭合率统计图(图2B、D),结果表明马钱子碱可以有效抑制骨肉瘤的横向迁移能力。在利用Transwell实验探讨细胞的纵向迁移能力(图2E、G),与对照组相比可以看出马钱子碱可以抑制骨肉瘤细胞的纵向迁移,骨肉瘤细胞的入侵数量统计图(图2F、H)进一步表明上述结果,而且差异具有统计学意义(P<0.01)。

A、C:马钱子碱对143B和HOS细胞横向迁移能力效果图:B、D:马钱子碱处理143B和HOS细胞伤口愈合率统计图;E、G:马钱子碱对143B和HOS细胞纵向迁移能力效果图;F、H:马钱子碱处理143B和HOS细胞的细胞侵袭数量统计图(与对照组相比,*P<0.01,**P<0.001,n=3)

2.3 细胞周期及凋亡分析

流式细胞术检测了细胞周期和细胞的凋亡,从细胞周期的DNA直方图(图3A、B、D、E)以及细胞周期的比例柱状图(图3C、F)可以看出给药后的S期细胞比例分别从49.67%增加到64.12%和40.45%增加到45.83%,G0、G1期的比例下降,G2期基本没有变化。在结合细胞凋亡图(图3G、H、J、K)分析可以看出给药后细胞早调细胞比例增加,细胞晚调和坏死细胞比例也增加,从图3的I、L可以直观看到细胞凋亡比例在加药后明显增加。由此得出结论马钱子碱能是诱导骨肉瘤细胞S期阻滞,并且也能够导致骨肉瘤细胞发生凋亡。

A:143B细胞空白组的细胞周期变化图;B:马钱子碱处理的143B细胞周期图;C:143B细胞周期分布柱状图;D:HOS细胞空白组的细胞周期变化图;E:马钱子碱处理的HOS细胞周期图;F:HOS细胞周期分布柱状图。与对照组相比,G-I: 马钱子碱处理143B骨肉瘤细胞后增加了143B细胞的凋亡,J-L:马钱子碱处理HOS骨肉瘤细胞后增加了HOS细胞的凋亡(与对照组相比,*P<0.001,n=3)

2.4 生物信息预测及Western blot结果分析

从上面的实验结果可以看出马钱子碱能够抑制骨肉瘤细胞143B和Hos增殖,抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭及S期阻滞,也能够导致骨肉瘤细胞发生凋亡。为了探究其深层机制,我们使用生物信息学技术预测了马钱子碱的3967个治疗靶点和骨肉瘤的160个靶点基因。然后我们将这些治疗靶点和靶点基因进行了交集处理得到了马钱子碱和骨肉瘤细胞的86个共同治疗靶点基因(图4A马钱子碱的2D分子图,B马钱子碱和骨肉瘤细胞的共同治疗靶点Venn图)。然后对于这些共同靶基因进行PPI(网络蛋白互作)得到关键的蛋白相互作用结果(图4C)。然后使用KEGG富集分析进一步分析潜在机制通路,可以彻底了解感兴趣基因的功能和途径富集信息,进而明确马钱子碱治疗骨肉瘤的具体分子机制(图4D)。我们得到了马钱子碱可能是通过PI3K-AKT信号通路在骨肉瘤中发挥抗癌作用。然后我们进行了蛋白实验验证,我们发现使用马钱子碱处理过的骨肉瘤细胞较对照组而言,p-PI3K、p-AKT、MMP9、CyclinD1、C-caspase9均表达下降(图4E),这些结果证明了马钱子碱可能是通过PI3K-AKT信号通路在骨肉瘤细胞中发挥抗肿瘤作用。

A:马钱子碱的2D分子结构;B:马钱子碱和骨肉瘤细胞的共同治疗靶点Venn图C:马钱子碱和骨肉瘤细胞的共同治疗靶点网络蛋白互作图;D:KEGG信号富集发现PI3K-AKT信号为潜在的信号通路图;E:经马钱子碱处理的骨肉瘤细胞PI3K-AKT、MMP9、CyclinD1、C-caspase9相关蛋白的表达情况

3 讨 论

骨肉瘤起源于间叶组织的原发性恶性骨肿瘤,早期隐匿,易转移,易耐药,虽然有手术与新辅助化疗的运用,但是整体的治疗效果仍有待提高,因此,急需寻找新的临床药物来提高骨肉瘤的治疗效果。

在本研究中,我们通过体外细胞实验的研究表明,在MTT细胞增殖活性实验中,骨肉瘤细胞随着马钱子碱浓度的升高细胞活性明显降低。结合EDU实验的结果明显看出经过马钱子碱药物处理后的细胞DNA含量大幅度降低,说明马钱子碱可以有效抑制骨肉瘤细胞的增殖。通过进一步的细胞克隆形成实验也验证了马钱子碱对骨肉瘤细胞的抑制确实有效。另外,通过细胞划痕实验检测了骨肉瘤细胞的横向迁移能力和伤口愈合能力,结果表明经过马钱子碱处理的骨肉瘤伤口愈合能力减弱,Transwell侵袭实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力受到抑制。

此外,我们还利用流式细胞技术检测了细胞活动周期和凋亡活性。细胞周期停滞和细胞凋亡是诱导细胞死亡的两种有效机制,在细胞周期中,G1期是DNA合成前期,S期是DNA合成期,G2期是DNA合成后期,S期在细胞周期的中起关键作用,细胞在S期开始分裂,DNA开始合成,细胞周期是决定细胞增殖的基本机制。在图3中的细胞周期直方图看到S期细胞明显增多,G0G1期细胞量减少。另外,由于Annexin V可以和细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)结合,正常情况下PS存在于细胞膜脂质双层的内侧,当细胞发生早调时PS会发生外翻,翻到细胞膜外侧,是细胞早调的标志物。在图3中细胞的二维散点图上,早调的细胞数量明显增加,比例也增加,当细胞出现晚调和坏死时,细胞膜通透性增加,加入的核酸染料PI会进入细胞与细胞核结合,在二维散点图上也不难看出,加了马钱子碱的骨肉瘤细胞晚调的细胞数量和比例也有明显增加的趋势。通过细胞凋亡实验,我们看到马钱子碱的实验组中,细胞早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞数量明显增加。综上得出,马钱子碱能够抑制骨肉瘤细胞增殖,使细胞阻滞在S期。在研究了细胞体外相关实验之后,我们运用生物信息预测和Western blot实验研究并验证了马钱子碱可能作用于PI3K/AKT介导的细胞信号通路从而影响骨肉瘤细胞的分子生物机制。

综上所述,实验结果表明马钱子碱可以抑制骨肉瘤的增殖、抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭及诱导骨肉瘤细胞的S期阻滞,也能够促进骨肉瘤细胞的凋亡,然后我们通过生物信息学技术预测了其发挥抗骨肉瘤细胞潜在的机制可能是PI3K/AKT介导的细胞信号通路,这为骨肉瘤的治疗提供了新的思路,也为临床药物的研发提供了新的理论依据。