基于ox-LDL信号通路探讨桑芪滋阴补肾汤对人脐静脉血管内皮细胞的影响及其作用机制

张卫丽,张卫红,刘海立,张文静 ,曹 岩

(1.唐山市中医医院心血管内科,河北 唐山 063000;2.唐山市丰润区中医医院中风一科,河北 唐山 064000)

高血压患者血管内皮细胞的形态、结构、功能等往往受到影响,进而诱发动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)[1]。颈动脉粥样硬化(Carotid atherosclerosis,CAS)属于全身动脉粥样硬化的一部分,可以作为反映全身动脉粥样硬化病变的“窗口”[2]。临床研究数据显示,超过70%的高血压患者往往伴有不同程度的颈动脉粥样硬化[3-4]。临床通常采用他汀类药物与降压药联合使用的方法来治疗CAS[4],但作用靶点单一,且部分患者头晕、头痛、恶心等临床症状无法得到缓解,久病后容易造成多种并发症[5],因此给患者的正常生活和身心健康造成了巨大的困扰。近年来有研究发现,细胞焦亡和炎症在AS的发生和发展过程中起关键作用[6],氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是AS的危险因素,其可通过增加氧化应激和炎性反应,诱导内皮细胞凋亡,并导致内皮损伤,进而促进AS发生和发展[7]。因此,减轻ox-LDL诱导的细胞损伤可能是防治AS的潜在机制[8]。

桑芪滋阴补肾汤由桑寄生、黄芪、白芍、制首乌、当归、炒杜仲、丹参、川芎、火麻仁、钩藤、天麻、炒谷麦芽、夜交藤和三七组成,具有补肝益肾、益气固表、活血祛瘀、养心安神的功效。且中药复方治疗疾病具有“多成分”“多通路”“多靶点”协同作用的优势,疗效确切,不良反应少。因此,本研究通过观察桑芪滋阴补肾汤对体外ox-LDL诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)细胞存活率的影响,以NLRP3/Caspase-1诱导的细胞焦亡信号通路为靶点,探讨桑芪滋阴补肾汤改善CAS的药理活性及潜在机制,为临床防治高血压颈动脉粥样硬化提供新的思路和治疗药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞:HUVEC细胞系由北京协和医学院研究所提供。

1.1.2 仪器:Real-Time PCR仪Q162D(河北三狮生物科技有限公司);蛋白核酸分析仪(德国Eppendorf公司);Odyssey双色红外激光扫描显影仪(美国Li-Cor公司);酶联免疫检测仪(美国Thermo公司);MK3酶标仪(日本岛津公司);荧光显微镜(Carl Zeiss公司);光学显微镜(北京英威泰科技有限公司);高速离心机(美国Thermo公司);移液枪(德国Eppendorf公司)。

1.1.3 药物与试剂:Ham’s F-12K培养液、胎牛血清、青链霉素混合液购自武汉普诺赛生物公司;ox-LDL购自美国Sigma公司;CCK-8试剂盒购自北京全式金公司;RIPA裂解液购自江苏凯基生物技术股份有限公司;一抗NLRP3、Caspase-1(货号:SH-bs-10021R、22915-1-AP)购自美国Abcam公司;内参一抗GAPDH(货号:PA1-988)购自美国Thermo公司;qPCR试剂盒:Taq pro Universal SYBR qPCR Master Mix(货号:Q712-02)购自中国诺唯赞公司;Trizol试剂(货号:15596018)购自美国invitrogen公司;PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司提供;IL-6、TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(批号:CAS148157-34-0/CAS94948-59-1)购自上海恪敏生物科技有限公司;辛伐他汀片购自哈药集团三精制药股份有限公司(批号:120100);中药饮片均购自北京同仁堂科技有限公司;水为屈臣氏纯净水。

1.2 实验方法

1.2.1 桑芪滋阴补肾汤水煎液的制备:取黄芪30 g,桑寄生、钩藤、夜交藤各20 g,白芍、炒杜仲、炒谷芽、炒麦芽各15 g,制首乌12 g,当归、丹参、火麻仁各10 g,川芎、天麻、三七各6 g;分别加10倍、8倍量水煎煮2次,合并两次煎液并浓缩至500 ml,备用。取适量浓缩液,用细胞培养液分别稀释100、1000、10000倍,作为高、中、低浓度桑芪滋阴补肾汤药液。

1.2.2 细胞培养及分组:将HUVEC分为空白对照组、模型组、高浓度桑芪滋阴补肾汤组、中浓度桑芪滋阴补肾汤组、低浓度桑芪滋阴补肾汤组和阳性药组。

HUVEC采用Ham’s F-12K培养液(加0.1 mg/ml肝素、0.03 mg/ml的内皮细胞生长因子、10%胎牛血清、1%青链霉素混合液)在37 ℃、含5%CO2的培养箱中孵育,取对数生长期的细胞,用培养液调整细胞密度至5×104个/ml,每孔100 μl接种于96孔板中。空白对照组HUVEC细胞正常培养;模型组HUVEC细胞加入5 μl含200 μg/ml ox-LDL培养液孵育24 h[9];低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组和阳性药组HUVEC细胞分别加入5 μl相应浓度的桑芪滋阴补肾汤药液和5 μl浓度为10 μmol/L的阿托伐他汀的培养液预处理24 h[10],然后给予和模型组相同的处理。

1.2.3 CCK8法检测细胞存活率:HUVEC细胞在培养液中按分组处理并继续培养24 h后,每孔加入10 μl CCK-8工作液,培养1 h后测定各组细胞的吸光度(A)值,并计算细胞存活率[11]。细胞存活率(%)=实验组A值/空白对照组A值×100%[12]。

1.2.4 RT-PCR法检测细胞中VEGFA的mRNA表达水平:采用Trizol试剂提取细胞RNA样品,按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,用逆转录试剂盒逆转录总RNA得到的cDNA,并根据qPCR试剂盒说明,使用Real-Time PCR仪进行Real-Time PCR反应,记录数据,以Actin为内参,根据CT值计算VEGFA的mRNA 表达水平。用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot法检测细胞中NLRP3、Caspase-1的蛋白表达情况:使用预冷的PBS冲洗各组HUVEC细胞后,加入RIPA缓冲液进行裂解,离心后提取组织蛋白并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离各组HUVEC细胞蛋白样品,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭,分别孵育不同的一抗,加入比例为NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶1000)以及内参GAPDH(1∶4000),保持4 ℃过夜,漂洗膜后,在室温条件下二抗(1∶2000)孵育2 h。洗涤3次后加入显影液,化学发光成像系统中曝光观察,得到NLRP3、Caspase-1和GAPDH蛋白条带,采用Image J软件扫描蛋白条带的灰度值,并对NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平进行分析。

1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中IL-6和TNF-α水平:收取各组细胞上清液,根据ELISA试剂盒说明书进行操作,检测各组细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量。

1.3 统计学方法 使用SPSS 26.0统计学软件进行实验数据处理和分析。计量资料以均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析;P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞存活率比较 与模型组比较,桑芪滋阴补肾汤各组可以显著提高细胞存活率(P>0.05),且呈剂量依赖性,其中高浓度桑芪滋阴补肾汤组的活性与阳性药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞存活率比较

2.2 各组细胞中VEGFA的mRNA表达水平比较 与空白对照组比较,模型组细胞中VEGFA的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),提示造模成功。与模型组比较,低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞中VEGFA的mRNA表达水平逐渐升高(P<0.05);与阳性药组比较,低、中浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞中VEGFA的mRNA表达水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞中VEGFA的mRNA表达水平

2.3 各组细胞中NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平比较 与空白对照组比较,模型组细胞中NLRP3和Caspase-1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),提示造模成功。与模型组比较,低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞中NLRP3和Caspase-1的蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05);与阳性药组比较,低、中浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞中NLRP3和Caspase-1的蛋白表达水平升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞中NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平比较

2.4 各组细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量比较 与空白对照组比较,模型组细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量显著升高(P<0.05),提示造模成功。与模型组比较,低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞上清液中IL-6、TNF-α的含量逐渐降低(P<0.05);与阳性药组比较,低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞上清液中IL-6、TNF-α的含量升高(P<0.05)。见表5。

表5 各组细胞上清液中IL-6和TNF-α含量比较(pg/ml)

3 讨 论

高血压是临床常见的心血管疾病之一,高血压患者的机体血压长期处于高位状态会造成血管壁张力和切应力的改变,还会损伤血管内皮细胞,进而引发AS[13-14]。临床研究数据显示,高血压患者的 CAS检出率比血压正常者更高[15],说明高血压可能会加速CAS的发生和发展。临床治疗高血压伴颈动脉粥样硬化多采用他汀类药物与降压药物合用[16],其对于改善患者临床症状有一定的效果,但同时也存在疗效不稳定、不良反应大等弊端[17],而中医药在治疗高血压合颈动脉粥样硬化方面积累了丰富的临床经验,并取得了较好的治疗效果。

临床研究表明,桑芪滋阴补肾汤对于高血压引发的颈动脉粥样硬化具有良好的治疗作用。方中以桑寄生、黄芪为君药,桑寄生长于补肝益肾;黄芪善于益气固表、升阳健脾、以固后天之本;制首乌、杜仲、白芍用作臣药,以助君药补肝益肾、活血生津之效,白芍敛阴柔肝,平抑肝阳;制首乌补肝益肾,滋阴补血;杜仲温而不燥,补肝益肾;丹参、川芎、当归气血同调,补而不滞,活血祛瘀,燥中有润;天麻、钩藤能平肝潜阳;夜交藤养心安神,除烦通络;火麻仁健脾补气,强肾;谷麦芽用作使药,能消食开胃,以补养先天之虚。全方合用,共同发挥补肝益肾、益气固表、活血祛瘀、养心安神之效。因此本文对桑芪滋阴补肾汤对HUVEC细胞损伤的保护作用进行研究,并探讨其起效机制,以期为高血压合颈动脉粥样硬化的临床治疗提供新的思路。

VEGFA是一种具有促进内皮细胞增殖作用的细胞因子,是血管生成中最重要的调节因子,其基因表达水平与血管形成密切相关[18],因此VAGFA的表达水平可以作为评价药物血管保护作用的重要指标。RT-PCR检测结果表明,与模型组比较,低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞VEGFA的mRNA表达水平逐渐升高,说明桑芪滋阴补肾汤可以呈剂量依赖性上调VEGFA基因的表达,且高浓度桑芪滋阴补肾汤上调VEGFA基因表达水平的作用与阳性药比较无统计学差异。

ox-LDL是AS的危险因素,近年来的研究发现,ox-LDL可以通过诱导细胞焦亡、损伤内皮细胞、促进炎症反应等途径参与AS的形成与发展[19]。NLRP3是目前研究最多一种炎症介质[20]。研究表明NLRP3/Caspase-1信号通路诱导的细胞焦亡和炎症反应与AS密切相关[21-22],因此可以将NLRP3和Caspase-1的表达水平作为评价药物对CAS改善作用的重要指标。Western blot检测结果表明,与模型组比较,低、中、高浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞NLRP3和Caspase-1的蛋白表达水平逐渐降低,说明桑芪滋阴补肾汤可以呈剂量依赖性下调NLRP3和Caspase-1基因的表达,且高浓度桑芪滋阴补肾汤下调NLRP3和Caspase-1基因表达水平的作用与阳性药比较无统计学差异。

IL-6和 TNF-α是参与机体炎症反应的两种重要因子[23],可以根据所处环境的不同发挥促炎或抑炎的作用[24]。研究发现,IL-6与相应的受体结合后,可以发挥调节转录水平、诱导受体表达以及促进炎症发生和发展等作用[25]。且在病理机体中,TNF-α炎症因子可以促进IL-6等因子的分泌,使炎症反应加剧[26]。本研究ELISA检测结果显示,模型组细胞上清液中IL-6、TNF-α的含量远高于空白对照组;与模型组比较,三浓度桑芪滋阴补肾汤组细胞上清液中IL-6、TNF-α的含量降低,且含量降低水平与药物浓度呈正相关,说明桑芪滋阴补肾汤可以呈剂量依赖性下调IL-6和TNF-α等炎症因子的表达。

综上所述,本研究通过ox-LDL诱导HUVEC细胞损伤模型,探讨了桑芪滋阴补肾汤对HUVEC细胞损伤的保护作用及起效机制。本研究结果表明,桑芪滋阴补肾汤对HUVEC细胞损伤具有改善作用,可显著上调细胞中VEGFA的基因表达水平,下调细胞中NLRP3、Caspase-1的基因的表达水平和细胞上清液中IL-6、TNF-α的基因表达水平,减少炎症反应及血管病变。提示其作用机制可能是通过NLRP3/Caspase-1诱导的细胞焦亡信号通路,上调VEGFA基因的表达水平,下调NLRP3/Caspase-1基因的表达水平及病理状态下IL-6和TNF-α等炎症因子的表达水平,来发挥血管保护和炎症保护作用。以上实验结果为桑芪滋阴补肾汤的临床应用提供了科学依据及参考,一定程度上阐释了桑芪滋阴补肾汤治疗高血压合颈动脉粥样硬化的科学内涵。