调肝清心冲剂治疗室性早搏分子机制研究

姚继红,孙樱丹,张海燕,王丹妮

(烟台市烟台山医院,山东 烟台 264008)

室性早搏是一种常见的临床心律失常,也称为室性期前收缩,是由于心室内某异位室内节律电脉冲过早导致的心脏去极化,常发生在冠心病和心肌病等器质性心脏病中[1-2]。室性早搏在临床上的发病率和致残率较高,轻症患者仅存在心悸不适,重症患者则出现心室颤动等,如果不及时治疗,患者会诱发心力衰竭等恶性心血管事件,严重威胁患者的生命安全[3]。目前,西医常用抗心律失常药物,钾拮抗剂、钠拮抗剂、β受体拮抗剂和钙拮抗剂以及射频消融手术来治疗室性早搏,但易出现负性肌力等不良反应[4],整体效果不佳。中医学中将室性早搏划分为“心悸”“怔忡”等范畴,目前多数医家认为其病机为本虚标实[5]。基于此,本研究通过观察大鼠模型实验,探讨调肝清心冲剂的作用机制,阐明缺血性室性早搏的发病机制并提出针对性的治疗;通过观察大鼠模型实验,探讨调肝清心冲剂灌胃预处理对缺血性心律失常大鼠心肌酶学、心律失常发生率及间隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探讨其治疗室性早搏的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:实验于2016年5月至2017年5月进行。清洁级SD大鼠购自山东省实验动物中心,由40只6～8周龄的SD大鼠(雌雄各半,体重180～220 g)作为受体。本实验经烟台市烟台山医院医学伦理委员会批准(批准号:烟山伦准2023050号)。

1.1.2 实验药物:稳心颗粒(规格:9 g/袋,国药准字Z10950026,厂家:山东步长制药股份有限公司)。调肝清心冲剂组成:珍珠母、炒枣仁、葛根、赤芍、白芍各30 g,全瓜蒌、石菖蒲各15 g,柴胡、枳壳、郁金、半夏、苦参、炙甘草各10 g,黄连6 g,中药药材由北京同仁堂药店提供,水煎并浓缩,制成冲剂备用。

1.2 实验方法 分组处理及模型建立:按随机数字表法将SD大鼠分为假手术组、模型组、稳心颗粒组、调肝清心冲剂治疗组四组,每组10只大鼠(雌雄各5只),共40只实验大鼠。假手术组采用0.9%NaCl溶液等剂量灌胃;模型组采用0.9%NaCl溶液等剂量灌胃;稳心颗粒组采用1 ml/100 g(相当于4.28 g生药/kg体重)的剂量每天1次灌胃,在手术前7天开始;调肝清心冲剂治疗组,1 ml/100 g(相当于4.28 g生药/kg体重)的剂量每天1次灌胃,在手术前7天开始。模型制备:连续用药7 d后,对大鼠进行称重,并通过腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉。将大鼠以俯卧姿势固定在老鼠床上,并进行气管切开。将大鼠的四肢皮下连接到BL-420E生物功能实验系统,并记录标准的Ⅱ导联心电图。通过开胸,在左胸骨第三和第四根肋骨之间挤出心脏,并通过冠状动脉前降支下的1号丝线将心脏重新定位,收紧丝线5 min,松开5 min,共3次;当心电图监测中ST段明显升高时,即认为缺血成功。假手术组大鼠仅开胸,不施行冠脉结扎。

1.3 观察指标

1.3.1 室性早搏出现的时间和持续时间:在灌注后30 min内通过心电图监测记录各组室性早搏出现的时间和持续时间。

1.3.2 室性早搏和室性心动过速的发生频率:在灌注后30 min内通过心电图监测记录室性早搏和室性心动过速的发生频率。

1.3.3 心律失常评分:采用Mest法[6]评估心律失常评分,窦性心律为0分;室上性心律失常,Ⅰ度房室传导阻滞为20分;Ⅱ度房室传导阻滞,室性早搏二联律、三联律为40分;多源性室早、阵发室速为60分;心室颤动为80分;死亡为100分。

1.3.4 血清中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)水平、Cx43含量:检测完心电图后,从腹主动脉采集5 ml血液,在室温下储存8 h,以3000 r/min离心10 min,上清液储存在-20 ℃的冰箱中,采用速率法测定LDH、CK水平;Western blot法测定大鼠左室心肌组织细胞Cx43的表达:将心室心肌组织从-80 ℃的冰箱中取出,在冰上研磨后加入裂解液,从每组心肌组织中提取总蛋白,用BCA试剂盒定量,确定每组的总蛋白浓度,在12%的SDS-PAGE分离凝胶上电泳后,用5%的脱脂牛奶洗膜2 h,彻底洗净用兔抗Cx43大鼠一抗(1∶1000,Affinity,美国)孵育过夜;第2天,加入HRP结合的二抗(1∶1000,北京博奥森生物技术有限公司,中国),在室温下摇晃孵育1 h,然后ECL显影并使用全自动化学发光成像系统(Tanon-5200上海天能科技有限公司,中国)曝光。用图像处理软件Image J分析灰度带值,用GAPDH(1∶1000,Bioword,美国)作为内部参考计算相对蛋白含量。

2 结 果

2.1 各组大鼠室性早搏出现时间和持续时间比较 与假手术组、模型组、稳心颗粒组比较,调肝清心冲剂治疗组的室性早搏出现明显增加和持续时间明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠室性早搏出现时间和持续时间比较(min)

2.2 各组大鼠室性早搏和室性心动过速发生率比较 调肝清心冲剂治疗组的室性早搏和室性心动过速的发生率均低于假手术组、模型组、稳心颗粒组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠室性早搏和室性心动过速发生率比较[例(%)]

2.3 各组大鼠Mest评分比较 与假手术组、模型组、稳心颗粒组比较,调肝清心冲剂治疗组的Mest评分明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠Mest评分比较(分)

2.4 各组大鼠血清LDH、CK水平比较 与假手术组、模型组、稳心颗粒组比较,调肝清心冲剂治疗组的血清LDH、CK水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠血清LDH、CK水平比较(U/L)

2.5 各组大鼠心肌组织Cx43含量比较 与假手术组、模型组、稳心颗粒组比较,调肝清心冲剂治疗组的Cx43含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 各组大鼠心肌组织Cx43含量比较

3 讨 论

研究表明,常规24 h动态心电图的室性早搏发生率为40%～75%,其发生率随年龄增长而呈上升趋势[7-8]。室性早搏临床常见症状有心悸、呼吸困难、晕厥等,它能引起收缩期左心室功能障碍,诱发心室相关的心肌病,对患者的生活质量造成严重影响[9-10]。随着现代生活方式和生活方式的改变,室性早搏的发病率越来越高,如工作压力增大,过量饮酒、吸烟、食用脂肪和甜食,部分患者常伴有情绪不稳定、焦虑和抑郁,这些都会加重心悸症状,形成恶性循环[11]。目前,西医主要使用抗心律失常药物来治疗室性早搏,但西药的不良反应和导管消融术的创伤性操作令部分患者难以受益[12]。

近年来,中医中药作为治疗室性早搏的重要手段,受到了患者的欢迎,现代中医认为,心悸的主要病理是血液充盈、脉络不通,治疗应以活血为主[13]。而有些学者认为,心悸的主要原因是心脾两虚,治疗应以健脾养心、补气养血为主[14-15]。本文选用的调肝清心冲剂,方中柴胡、枳壳共为君药,疏肝理气为主;郁金、赤芍、白芍、全瓜蒌、半夏、黄连合而为臣药,清热燥湿、化痰活血;苦参、石菖蒲、葛根、珍珠母、炒枣仁共为佐药,宁心安神定悸;炙甘草养阴生津、益气复脉为使药,全方主疏肝理气、宁心安神。本研究结果中,调肝清心冲剂治疗组的室性早搏和室性心动过速的发生率以及室性早搏出现和持续时间明显增高,且Mest评分明显降低,提示调肝清心冲剂能够缩短早搏出现时间和持续时间,并减少心率失常的发生个数。本研究使用药方以疏肝理气为先,柴胡疏肝解郁,枳壳行气消胀。李三洋等[16]以疏肝汤加减治疗肝郁气滞型室性早搏,患者服用1月余病愈且无复发;以化痰清热为助,郁金清心活血,全瓜蒌辛温化燥;另加以珍珠母、炒枣仁安神定悸。

LDH是与蛋白质结合的酶,在脏器障碍和重症感染症中表达显著上升,水平越高表示病情越严重[17]。CK广泛存在于骨骼肌、心肌及大脑组织中,能够维持细胞能量的稳态,其水平可以反映潜在疾病过程中的严重程度和肌肉失神经的程度[18-20]。本研究结果中,调肝清心冲剂治疗组的血清LDH、CK含量与其他组比较明显降低,Cx43含量明显增高,提示室性早搏的发病机制可能与降低LDH、CK水平,增加Cx43含量有关。安丽等[21]的研究指出,心肌缺血后再灌注损伤后容易出现再灌注心律失常,心律失常的发生与Cx43表达减少有关。中药的现代药理学研究为中药治疗室性早搏提供了理论依据。本研究选用的药方中,柴胡提取物对中枢神经有明显的抑制作用[22],黄连抗心律失常,能够降低心肌自律性[23],白芍提取物具有镇静作用[24],全方化痰清热疏肝理气,在抗心律失常方面具有较大的优势。

综上所述,调肝清心冲剂灌胃能够降低心肌缺血模型大鼠心律失常的发生率,其机制可能与降低LDH、CK水平,增加Cx43含量有关。