肝移植术后侵袭性曲霉菌病的诊疗进展

潘胜辉，孙江波，徐 剑

（海南医学院第二附属医院器官移植科，海南 海口 570105）

侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD），又称侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI），是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理生理过程。肝移植（liver transplantation，LT）受者IFI 的风险增加，发病率在所有LT 受者中占4%～40%，死亡率在25%～67% 之间［1］。长期以来，侵袭性曲霉菌病（invasive aspergillosis，IA）被公认是LT 最显著的机会性真菌感染之一，LT 受者IA感染后死亡率高达80%～90%［2］。早期诊断IA 和及时启动抗真菌药物治疗对于LT 术后患者的管理是至关重要的［3］，同时需对免疫抑制方案以及感染源的综合评估。本文就IA 的临床表现、诊断及治疗的新进展综述如下。

1 流行病学

肝移植是现代医学的重要进步之一，成为了终末期肝病的最佳治疗选择。肝移植患者为防止或治疗排斥反应，加强免疫抑制的强度，增加了IA 的风险。肝移植后患者IA 的发病几率在1%～9%之间［4-6］。国内外相关研究及指南指出［1，7-11］，LT 受者术后IA 包含许多危险因素，并且危险因素还在不断增加，目前包括严重的免疫功能障碍、终末期肝病模型评分＞30、糖尿病、长期住院、肝炎和肝外衰竭、住院期间创伤性操作、手术时间长、大量的输入血制品、术后留置引流管、中心静脉导管、长期抗生素疗法、排斥反应、急性肾损伤、肾衰竭、需要连续肾脏替代疗法（CRRT）的患者、二次手术、再次移植、巨细胞病毒（CMV）感染、胆肠吻合术等。一些针对免疫细胞群和信号通路的制剂，包括恶性肿瘤和自身免疫性疾病，也被确定为IA 的危险因素。例如，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂广泛用于自身免疫性疾病，与感染和癌症的风险增加有关［12］。最早的研究发现，LT 受者在早期容易发生IA 感染，但是最近的流行病学研究发现IA 的感染向术后晚期（＞3 个月）转变［10］。因此，在评估LT 受者的IA 风险时，必须考虑所有相关因素，包括基础疾病、合并症（如先前存在的肺部疾病）和周围环境等。因侵袭性曲霉菌病的诊断较困难，对于其风险的识别能力需增强，需在LT 术后制定抗真菌预防策略［13］。在高风险的LT 受者进行针对性的预防治疗，使用抗真菌药物，可以减少IA 的发生率，特别是对于IA高危的肝移植等待患者。

2 临床表现

LT 术后患者抗真菌及免疫抑制剂方案及剂量不一，出现的症状亦不尽相同，并联合其它LT 术后并发症的发生，对IA 临床症状的识别有极大的挑战。随着影像技术的不断进展，结合临床上出现的可疑表现，使临床医生可提早识别LT 术后IA 的发生。

2.1 肺侵袭性曲霉菌病

由于最常见的接触机制是吸入曲霉菌孢子，肺成为了LT 受者中IA 侵袭最多的器官，因为IA 传播广泛，可侵入包括心脏、眼睛、肌肉、甲状腺和中枢神经系统（CNS）等全身各个部位［14，15］。肺侵袭性曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）是最常见IFI 类型，常常累及肺外器官感染并形成曲霉菌败血症［16］。IPA 无特异性临床表现，可出现发热、咯血、胸痛等症状，通过血液途径，可侵袭至全身各脏器，造成严重的后果。IA 患者无特异性的临床症状，并且LT 术后患者其他病原体感染的几率也增加，难以作出明确诊断。IPA 在CT 上可呈现多种模式：致密、边界清楚的病灶，伴或不伴晕轮征（结节状周围组织的衰减）、空气新月征（一种晚期且非特征性的影像）；空洞形成；楔形、节段或肺叶实变；支气管肺炎可出现反晕征［17］。曲霉菌对血管的亲和力使肺部血管损伤，形成梗死灶，当梗死灶中心发生凝固性坏死时，中心周围组织密度衰减，形成晕轮征。IA 晚期病灶坏死吸收形成含气空腔，CT检查可见典型的新月形空气征［18］。

2.2 非肺侵袭性曲霉菌病

非肺脏其余部位IA 感染较少，且临床表现无特异性。如在侵袭性真菌鼻窦炎中，可出现肺气管、支气管的溃疡、结节、伪膜、斑块或焦痂（支气管镜分析中观察到）、局部疼痛（可放射至眼睛）及伴有黑色焦痂的鼻溃疡，可延伸至眼眶［19］。该病发展迅速，并且诊断一般需要进行组织学或病理检查。

近年来，LT 患者术后患者CNS IA 逐渐报道。之前往往通过尸检及手术病理检查才能确诊。CNS 的IA 无特异性临床症状，可导致脑梗塞、脑血管炎、脑血管意外（中风）、出血、多发性或孤立脓肿和脑膜炎。免疫能力极差的患者可能会经历颅神经的多重改变，肉芽肿、脑脓肿和脑膜炎等。需要进行详细的神经系统查体；实验室评估包括血清曲霉菌抗原、血液、尿液和痰培养物、胸部放射图；大脑的磁共振成像与对比、腰椎穿刺、癫痫发作的脑电图、可能神经外科干预和活检是评估这些患者的关键因素［20］。在CT 上可见局灶性病灶及增强影像中可出现脑膜强化［11，13，21］，并注意是否存在鼻窦炎、心内膜炎及大血管损害等。

3 诊断

2019 年EORTC/MSG IFI 指南中规定，侵袭性真菌病分3 个级别的诊断：（1）确诊（proven）：无菌部位标本的镜检（包括微生物镜检、组织病理学和细胞病理学）或培养等提示真菌感染；（2）临床诊断（probable）：患者需符合宿主因素、临床标准和微生物学标准各1 项；（3）拟诊（possible）符合宿主因素和临床标准各 1 项，但不符合微生物学标准［13］。可能感染的诊断依据包括：宿主因素、临床表现和真菌学证据，其中（1，3）-β-D 葡聚糖不能作为侵袭性霉菌疾病的单一真菌学证据［22］。LT 受者宿主因素中主要包括实体器官移植、免疫抑制剂使用及皮质类固醇的使用。IA 临床表现无特异性，根据侵袭的器官部位不同，表现出不同的临床症状，并可能合并LT 术后其他并发症，难以识别。临床真菌学证据可从显微镜下、标本培养、血清学检查、影像学检查及分子生物学检查中获取。

IA 的诊断依赖于一种多层次的方法，该方法应考虑风险因素和当地流行病学，以及可用诊断工具的性能和局限性。IA 的早期识别和治疗具有挑战性，延迟或错过诊断与IA 更高的发病率和患者死亡率相关［23-25］。目前可用的诊断测试缺乏敏感性和特异性是导致诊断延迟的主要原因，及时诊断LT 受者的IA 需要很高的怀疑指数。当出现发烧、呼吸道症状或传播感染症状的患者，应使用先进的胸部成像，如计算机断层扫描（CT）进行评估，普通放射图可能会产生错误的阴性结果，不应用于排除肺感染。其他地方出现症状，如鼻窦，也应该有适当的成像模式，如专用鼻窦CT。鼻窦成像可能揭示入侵局部结构，但不可能区分导致侵入性真菌鼻窦炎的物种仍需行微生物学检查。曲霉菌脑脓肿在CT上表现为低密度影像，增强后呈环状强化；磁共振成像中，T1 低信号，T2 加权高信号。其强化的特点呈多样性，如呈结节状、锯齿状、花边状等［26］，MRI增强影像的强化程度随着病情的加重而增加。相较于CT 检查，CNS 更加推荐MRI 检查。

3.1 血清学检查

血清学检查可用于增加诊断依据，结合临床症状及影像学检查，用于诊断侵入性感染。因此，在过去二十年中，已经开发出了用于检测循环真菌细胞壁成分的非培养基生物标志物。其中一种诊断检测标记物是（1，3）-β-D 葡聚糖（BG），称为G 检验。这种真菌壁成分可在念珠菌、曲霉菌等真菌出现，但不能用于检测隐球菌及毛霉菌。G 检验能检测出真菌感染，不能确定真菌种类。在革兰阴性菌感染、头孢类药物使用时可出现假阳性。在BG 阴性时亦不能说明无真菌感染，可作为未接受抗真菌感染患者的高危患者的筛查检验项目［27］。G 检验的价值仍然相对较低，因为它缺乏曲霉菌片段的特异性［28，29］和有限的敏感性，特别是在肝脏移植受者，敏感度在58%～65%之间［25，30］。

另外，血清和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）半乳甘露聚糖检测（galactomannan，GM）被推荐为诊断IA 的标记［13］。血清GM 灵敏度为61%～79%，BALF-GM 灵敏度为58%～90%，血清GM 特异度为61%～79%，BALFGM 特异度为58%～90%［31］。在LT 患者中，不推荐血清GM 作为常规的筛查手段，特别是已经接受抗真菌感染的患者，可显著降低血清GM 的敏感性。其他的非特异性炎症指标，如C 反应蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）和降钙素原（PCT），迄今尚未在LT受者中用于评估或诊断IA。

3.2 聚合酶链式反应（PCR）

随着现代技术的不断进展，分子生物学检查方法也成为了诊断IA 的临床手段之一，比如PCR 技术及基因测序技术等等。不同液体样本（如全血、血浆、脑脊液、引流液等）及组织的PCR 检测对于临床诊断IA 的价值较大，特别对于具有感染几率大、感染病原体种类多等特点的LT 术后患者来说意义重大。PCR 的一个独特之处是它能够同时检测曲霉菌的种属，还能够直接从临床种属中鉴定与三唑类药物耐药相关的某些突变［32，33］。但是目前分级生物学检查技术暂不推荐作为常规检测手段。

PCR 可直接检测血液、血清或BALF 中的曲霉菌DNA，对筛查疑似IA 的高危患者有中等准确性。2019 年更新的Cochrane 综述纳入了29 项全血、血清或血浆PCR 研究，显示PCR 检测的合并灵敏度为79.2%，特异性为79.6%。对于两个或更多连续阳性结果，灵敏度更低，为59.6%，特异性提高至95.1%［34］。根据2012 年的系统综述，BALF-PCR 报告的灵敏度和特异性分别为77%和94%［35］。它具有极佳的阴性预测值（单次或连续检测约95%），连续性能和或与其他生物标志物联合使用可提高阳性预测值［34］。与GM 相比，PCR 灵敏度更高，但特异性略低，而系列阳性PCR 灵敏度更低，但特异性更高。与IA 释放的GM 和BG 标记物不同，曲霉菌DNA 可在无活动性血管侵袭性疾病的情况下检测到。尽管该试验不能区分活动性疾病和定植，但它确实为临床高度怀疑但影像学结果不一致的患者提供了早期开始抢先治疗的潜在机会，或为高危个体提供了抗真菌预防的潜在机会。

3.3 新一代测序

新一代测序（next-generation sequencing，NGS），也称为高通量/大规模平行测序，是一种新兴的诊断技术，用于识别CNS 的潜在病原体。从理论上讲，如果有足够长的测序读数、足够高的点击率和一个全包参考数据库，几乎所有的微生物都可以根据特定的核酸序列进行唯一识别。有许多可用的测序技术和数据分析软件包［36］。在没有特定靶标先验知识的情况下，从临床样本（包括血液、CSF、BAL 液等）中提取所有人类和微生物DNA。使用“鸟枪法”进行测序，去除人类DNA，并将结果与预形成数据库中的现有核苷酸序列进行比较。如果参考数据库中存在序列，则可以鉴定少见病原菌以及潜在的耐药突变。参考实验室收到标本后，检测周转时间通常为12～24 h。NGS 技术能够进行进化追踪，并用于识别各种真菌感染的爆发。随着成本的降低和数据库的扩大，NGS 可常规作为禁忌进行侵入性活检的辅助检查，所以NGS 测序技术诊断感染的临床应用和管理仍需明确。

3.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

为了指导抗真菌药物的选择，通常需要对培养物中生长的霉菌进行种属水平鉴定。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的优点是能够从商业和内部数据库中识别出广泛的物种谱。在过去10 年中，MALDI-TOF MS 在丝状真菌中的应用不断发展，但耗时的样品制备技术（生产商之间可能存在差异）以及光谱数据库和可用分离挑战集的局限性延迟了其广泛应用。培养霉菌分离株的机制和真菌生长阶段可能影响鉴定，因为液体与固体培养基中存在不同水平的菌丝体和孢子，其具有不同的蛋白质组指纹［37］。多项研究报道丝状真菌的鉴定率在15%～97%之间，取决于使用的平台和数据库，已被广泛用于真菌分离株［38］。许多市售平台及其管理的数据库之间存在显著差异，包括纳入的种属范围和用于种属鉴定的命名法，这可能使泛化具有一定挑战性。

MALDI-TOF MS 是常规微生物和分子方法的合理替代，用于从阳性培养物中鉴定菌种，尽管缺乏标准化处理技术和不完整的数据库光谱仍然是限制因素。在无法识别的情况下，需要额外的分子诊断技术。

3.5 曲霉菌GM 侧流试验（GM-LFA）

GM-LFA 是一种用于定性和定量检测血清和BAL 样本中曲霉菌GM 的免疫层析试验。实体器官移植（solid organ transplant，SOT）受者的BALF GM-LFA 检测性能各不相同，与血液恶性肿瘤患者相比，灵敏度和特异性较低［39］。GM-LFA 诊断SOT 受者IPA 的性能数据有限。该实验目前正在进行进一步的研究。

3.6 其他检验技术

在IPA 的诊断中，结合放射性跟踪器，如18 氟脱氧葡萄糖（代谢活性的标志物），在CT 和正电子发射断层扫描（PET）中有助于定位异常区域，但不能区分恶性肿瘤、感染或炎症［40］。目前正在研究更多的放射性跟踪器以更好地成像IPA。另外一种非侵入性检测方法使用呼出气检测IA 环境呼出释放的有机化合物，这可能是最简单和便宜的诊断IA 的生物标记物，但其效能还有待进一步认证。另外，在Kieren 等的研究中［41］，使用半乳糖呋喃糖特异性单克隆抗体（mAb476）优化的一种测流试纸试验，该抗体可识别烟曲霉菌感染后的尿液抗原，目前致力于相关的临床研究。

4 治疗及预防

LT 术后发生严重感染治疗的重要原则是减少或者停止免疫抑制剂的使用。因LT 术后受者的状况，包括基础疾病、并发症以及潜在的器官功能障碍等，IA 的治疗药物的选择是有限的及需要相当慎重的。此外，在LT 受者中，药物之间相互作用严重影响抗真菌药物的选择［8，42］。不同的抗真菌药物的独特毒性也增加了治疗LT 接受者IA 的复杂性［43］，比如伏立康唑（Voriconazole，VCZ）与他克莫司、西罗莫司之间存在重要的药物相互作用，所以在行IA抗真菌治疗时，对于免疫抑制剂方案需要根据患者的血药浓度进行调节，必要时减量或停用，特别是皮质类固醇剂量应当减少。

目前，国内外IA 的诊治指南指出［8，13，44］：伏立康唑（VCZ）作为治疗及预防IA 的首选药物，并对其进行药物浓度监测。部分LT 受者对伏立康唑耐药或治疗效果不满意时，可选用两性霉素B 及其进行补救治疗或者联合不同抗真菌药物治疗，但需尽量避免使用具有相同毒性的药物。在柳叶刀中Maertens 等［45］发表的一篇关于泊沙康唑与伏立康唑疗效的对比研究结果指出，可改善全身吸收的泊沙康唑静脉注射和片剂制剂可能是伏立康唑的有效替代药物，研究中泊沙康唑耐受性良好，受试者的治疗相关不良事件比伏立康唑组少，支持泊沙康唑作为IA 的一线用药。其他抗真菌药物单独治疗IA 的临床疗效有待研究。

VCZ 治疗LT 受者IA 推荐剂量为第一天6 mg/kg，静脉注射，q12h；维持剂量4 mg/kg，静脉注射，q12h，或者200～300 mg，口服，每天两次［1］。2018 年我国药理学推荐VCZ 浓度控制在0.5～5 μg/mL［44］，浓度过低或过高对患者预后及治疗造成很大的影响，过低者控制感染强度不足，过高导致肝功能损害与LT 术后并发症及其他药物毒性导致肝功能损害相混淆。并有研究指出，亚洲人群的伏立康唑浓度应控制在3 μg/mL 以内，若超过这个指标，LT 患者术后肝毒性发生率增加［46］。治疗IA 流程疗程一般6～12 周，具体治疗因人而异，治疗终止标志为：影像学检查、真菌学、病原学检查、临床症状都找不到IA 的证据［8，47］。

由于唑类药物对细胞色素P450 的抑制作用，钙调磷酸酶治疗以50%的剂量开始，需重新确定适当的他克莫司浓度。在完成90 d 伏立康唑预防后，因伏立康唑停药时细胞色素P450 活性的增加，需要增加钙调磷酸酶剂量以达到适当的血药浓度水平［16］。如果患者出现神经功能障碍，可服用环孢素替代他克莫司。

目前最新研究发现，VCZ 耐药菌株的出现使VCZ 首选的方案受到了威胁［48］，比如烟曲霉CYP51A 基因的遗传改变。并有研究发现，在一些集合中超过50%的菌株中也报告了无CYP51A 突变的三唑类药物耐药株［49］。最近，有研究发现3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶编码基因（hmg1）的突变，并与许多临床烟曲霉分离株的三唑类药物耐药性相关［50，51］。hmg1 基因突变的流行率及其在烟曲霉三唑类药物耐药中的作用尚不清楚。需要进一步研究来解开hmg1 突变的机制作用和临床意义。Neofytos 等［1］研究发现，全球范围内越来越多的烟曲霉出现多重三唑耐药的报告，在大多数情况下是由于TR34/L98H 突变。

标准抗真菌药物治疗IA 患者面临众多挑战。十多年来没有新一类抗真菌药物被发明，对唑类药物耐药的真菌分离株数量稳步增加，常规抗真菌药物有着严重的药物毒性。免疫治疗方法有望改善抗真菌治疗，以降低高死亡率。在免疫功能低下患者中，这通常涉及治疗性免疫增强，包括细胞治疗方法，如先天（粒细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞）和适应性免疫系统（T 细胞）的细胞输注以及不同细胞因子、趋化因子和抗体的给药［52］。但细胞治疗在移植患者中使用中存在诱发致命性排斥反应，炎症因子爆发等风险，如何规避这些风险的发生，成为了目前细胞治疗的重点，目前仍在不断地研究当中。这些方法在未来可能作为辅助治疗甚至是单独治疗。

LT 患者免疫功能低下，IA 感染后病情发展迅速，不仅影响移植肝的功能，影响患者生存质量，并且IA 后大大增加了LT 患者的治疗费用，所以，对于IA 的预防治疗是必要的。伏立康唑的预防方案通过肠内途径给药，因为生物利用度高（＞83%）（74%～94%），易于给药，相对于静脉给药的成本低。此外，根据Johnson 等的数据，口服伏立康唑的药代动力学（PK）不受肾损害的显著影响。因此，无需针对轻度至重度肾损害患者的口服给药或CRRT 使用进行调整。LT 受者普遍接受逐渐减量的他克莫司以及泼尼松和吗替麦考酚酯作为免疫预防。

5 总结

LT 术后IA 的原因是多方面的，单纯依靠独立的检查手段难以完成对IA 的诊断，新的标志物及更先进的检查手段表现出一定的潜力。术后如何优化抗排斥药物及IA 相关检测至关重要，对于高风险患者应动态检测IA 感染指标，并行真菌学检查，出现感染时积极给予治疗，免疫抑制剂停用或减量是重要原则。在LT 术后IA 治疗的治疗手段中，伏立康唑为首选药物，但在不断地研究中，可能会有代替药物或代替治疗方法的出现。总之，LT 术后IA的发生严重影响患者的预后，应做到早期诊断、早期治疗，提高LT 受者生存质量及生存周期。

作者贡献度说明：

潘胜辉：搜集相关文献及论文书写；徐剑：文章项目构思及审核；孙江波：参与文献搜集、整理。

所有作者声明不存在利益冲突关系。