SREBP1 在乙肝病毒感染相关性肝细胞癌中表达意义的探讨

邓慧孜，郑 晶，翁 阳，魏 尚

（海南医学院第一附属医院病理科，海南 海口 570100）

原发性肝癌是全球恶性肿瘤最常见的类型之一，在所有癌症中发病率居第6 位、死亡率居第3位［1］。在原发性肝癌的所有病理组织学类型中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最主要的类型，占其中75%～85%［2］，更是原发性肝癌中的研究重点。在我国，肝细胞癌主要的致病危险因素包括慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV）感染与黄曲霉毒素暴露［3］。慢性乙型肝炎病毒长期感染人体后，使肝细胞处于慢性炎症刺激状态，损害肝脏的脂质合成、代谢及储藏功能。当肝脏调节脂质的功能受损后，肝细胞内脂质代谢异常，促进正常肝细胞转变为肝纤维化及肝癌［4］。

近年来，许多研究证明当细胞肿瘤变时，体内三大营养物质发生代谢重编程［5，6］，特别是以脂质从头合成（de novo lipogenesis，DNL）为主要特征［7-9］。脂质从头合成在恶性肿瘤发生、发展过程中占据非常重要地位［10］。固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding proteins 1，SREBP1）是人体内调控脂质合成代谢的重要核转录因子，可调控整个脂质从头合成途径中限速酶基因转录与表达［5，11-13］，导致脂质合成异常增多，从而为肿瘤细胞无限快速生长提供重要的原料与能量。近年来多项研究指出，SREBP1 在多种肿瘤中表达上调，例如脑胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌等，并且很大程度影响着肿瘤各种恶性生物学行为的转化［14］。

在我国乙肝病毒感染相关性肝细胞癌非常常见，且慢性乙型肝炎病毒感染及SREBP1 表达上调均能影响肝细胞脂质代谢并促进肿瘤的发生和进展，但目前关于SREBP1 表达与乙肝病毒感染相关性肝细胞癌的病毒DNA 水平等临床病理特征的相关性研究报道却较少。本研究拟通过免疫组织化学染色方法检测SREBP1 蛋白质水平在乙肝病毒感染相关性肝细胞癌中的表达情况，探讨SREBP1表达与乙肝病毒DNA 水平等临床病理特征的相关性，为乙肝病毒感染相关性肝细胞癌发生与发展相关机制提供新的研究方向。

1 资料和方法

1.1 样本收集

收集2019 年8 月1 日～2022 年6 月3 日在海南医学院第一附属医院住院，行外科手术切除治疗后，经过我院临床及病理证实的乙肝病毒感染相关性肝细胞癌组织及配对癌旁肝组织样本共91 例。收集每例样本的癌旁肝组织与肝细胞癌组织距离均≥2 cm。病例纳入标准：（1）临床资料较完整；（2）无术前放疗、化疗病史；（3）无其它恶性肿瘤者；（4）无其它类型肝炎病毒感染者。本研究标本使用经过海南医学院第一附属医院伦理委员会讨论通过，参加本研究的所有肝细胞癌患者或家属均签署了书面知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 组织芯片制作 所有收集的样本均经临床医生指导后完成取材，再浸泡于足量的10%中性福尔马林固定剂（4% 甲醛溶液）、室温下充分固定10～12 h，最后制成石蜡标本，再按照传统病理组织石蜡切片制备技术制成HE 切片。光学显微镜下选取代表性区域：肿瘤组织选取出血坏死少且肿瘤细胞集中区域，配对癌旁组织避开肝细胞脂肪变区域。然后应用空芯针制备组织芯片。从每个组织蜡块的代表性区域钻出直径约1.4 mm 的圆柱体，按顺序和数量依次以规则的阵列方式嵌入制备好的石蜡毛坯模孔中，并在合适位置选取唾液腺组织作为标志。石蜡模块平置于包埋模具上，表面淋热蜡封边，在60 ℃恒温干燥箱内烤60 min，使石蜡稍融化以封闭组织块，然后取出石蜡模块在室温下静置约10～15 min 冷却，再放入4 ℃冰箱充分冷冻后取出脱模。

1.2.2 免疫组织化学染色方法（Envision System 二步法）上述已制备好的组织芯片石蜡包埋块切白片，厚度3.5～4 μm。经常规60 ℃恒温干燥箱内烤片过夜或65 ℃烤片约2～3 h，使组织中及周边的石蜡充分融化；二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、双氧水阻断内源性过氧化物酶、Tris-EDTA 修复抗原，冰浴冷却后在37 ℃恒温箱内孵育SREBP1 第一抗工作液（美国 Santa Cruz 公司，sc-365513，稀释比例1∶50）40 min，再经第二抗体（山羊抗鼠兔，福州迈新公司）封闭、DAB（福州迈新公司）显色、苏木素复染，分化，返蓝及封片后，最后由3 名病理资深医师采用双盲法独立完成判读，每块组织均随机选取十个视野进行判读计数，最后以总平均数作为最终结果。SREBP1 蛋白免疫组织化学染色方法结果判读：阳性为细胞质或细胞核中显示颗粒状或点状的黄色、棕色或褐色着色。染色表达强度无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；阳性表达范围＜1%为0 分，1%～24%为1 分，25%～49%为2 分，50%～75%为3 分，＞75%为4 分。染色最终分数=染色表达强度×阳性表达范围。本研究将染色最终分数≤3 分，定义为SREBP1 蛋白低表达组；染色最终分数＞3 分，定义为SREBP1 蛋白高表达组［15］。

1.3 统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 26.0 统计学软件进行实验结果数据处理分析，以P＜0.05 定义为差异具有统计学意义。计数资料均采用χ2检验，结果以率或百分比表示。

2 结果

2.1 SREBP1 蛋白在肝细胞癌组织及癌旁肝组织中的表达情况

在肝细胞癌中，SREBP1 蛋白主要于细胞核内呈现棕黄色和（或）棕褐色颗粒染色（图1D）；而在癌旁肝组织内，SREBP1 蛋白主要在细胞质呈现淡黄色或几乎无着色（图1B）。免疫组化检测及统计学分析结果：91 例乙肝病毒感染相关性肝细胞癌组织中80 例SREBP1 蛋白高表达，11 例低表达，高表达率为87.91%（80/91）；91 例癌旁肝组织中4 例SREBP1 蛋白高表达，87 例低表达，高表达率为4.40%（4/91）。与癌旁肝组织相比，SREBP1 蛋白在乙肝病毒感染相关性肝细胞癌中表达明显上调（χ2=127.701，P＜0.001），见表1。

表1 SREBP1 蛋白在91 例肝细胞癌与癌旁肝组织的表达比较Tab 1 Comparison of SREBP1 protein expression in 91 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissues

图1 免疫组化检测SREBP1 蛋白在肝细胞癌、癌旁肝组织中的表达（×400）Fig 1 The expression of SREBP1 protein in hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissues was detected by immunohistochemistry（×400）

2.2 SREBP1 蛋白表达与在肝细胞癌患者临床病理特征的关系

对91 例乙肝病毒感染相关性肝细胞癌患者SREBP1 蛋白的表达与临床病理特征相关性进行分析，结果显示SREBP1 蛋白的表达水平与肿瘤分化程度（χ2=6.262，P=0.012）及远处转移或局部复发相关（χ2=4.243，P=0.039）：在中低分化肝细胞癌组中SREBP1 蛋白呈现高表达趋势，高表达率为92.21%（71/77）；在有远处转移或局部复发肝细胞癌组中SREBP1 蛋白高表达率为95.35%（41/43）。而与患者年龄、性别、肿瘤最大径、微血管转移、门静脉侵犯、卫星灶、淋巴结转移均无相关性，见表2。在91 例乙肝病毒感染相关性肝细胞癌患者中，与乙肝病毒DNA 低载量组（0～10³ IU/mL）相比，SREBP1 蛋白的表达水平在乙肝病毒DNA 高载量组（＞10³ IU/mL）中明显上调（χ2=4.287，P=0.038），见表3。

表2 91 例肝细胞癌中SREBP1 蛋白表达与临床病理特征的关系Tab 2 The relationship between the expression of SREBP1 protein and clinicopathological features in 91 cases of hepatocellular carcinoma

表3 91 例乙肝病毒感染相关性肝细胞癌SREBP1 蛋白表达与乙肝病毒DNA 载量的关系Tab 3 The relationship between SREBP1 protein expression and HBV DNA load in 91 cases of HBV infection-associated hepatocellular carcinoma

3 讨论

肝细胞癌是全球患病率、死亡率极高的恶性肿瘤。近年来，众多学者从筛选肝细胞癌的致病危险因素到早期诊断，接着探索可评估肝细胞癌预后和监测治疗效果的分子标记物，再到研发新型靶向治疗药物及探讨各种耐药机制等方面均取得了一定的进展［16-18］。肝细胞癌发病隐匿、肿瘤生长迅速，时常合并肝内或远处转移，处于肿瘤晚期阶段的患者治疗方式非常有限，治疗经济负担沉重且疗效不理想，以上现象表明肝细胞癌预后不容乐观。因此，寻找促进肝细胞癌发生、发展的分子标记物对提高肝细胞癌早期诊断率、判断疾病预后至关重要。

许多学者研究发现，肝细胞癌其中一个重要致病原因是代谢相关脂肪性肝病（metabolic associatedfatty liver disease，MAFLD）［19-21］，脂质代谢异常在肝良性病变，甚至是肝癌的发生、发展中起到重要的作用。SREBP1 是一种调控脂质合成的核转录因子，其在脂质从头合成途径中扮演着关键角色。DNL 是将循环中的碳水化合物（如葡萄糖）和氨基酸（包括谷氨酰胺）中的碳转化为脂肪酸的过程，脂肪酸可以进一步与甘油缩合成甘油三酯或其他脂质。从头合成的脂质既可以为肿瘤细胞提供生物膜基质，又作为第二信使传递关键信息，还是能量的重要来源，故脂质从头合成在恶性肿瘤发生、发展过程中占据非常重要地位［10］。Jun 等［22］研究表明胆固醇的累积通过P53 被抑制及活化β-catenin 的促癌途径加速肠癌进一步发展；Wu 等［23］研究发现肝细胞癌的增殖和转移与以3P-羟基类固醇-A24 还原酶为媒介转导的胆固醇代谢在人体肝细胞癌组织中高表达息息相关；Blucher 等［24］指出脂肪酸能够加速乳腺癌细胞的生长和迁移，Takumi 等［25］认为淋巴瘤可因肿瘤周围微环境被脂肪酸改变进而导致肿瘤发生及发展。以上研究均证实脂质代谢能增进肿瘤的活性。生理情况下，SREBP1 先以无活性状态停留在内质网膜上，当被激活后迁移至细胞核中，促进脂质合成相关靶基因的转录及表达。

本实验研究在组织芯片基础上，通过免疫组织化学染色方法，检测SREBP1 蛋白在91 例乙肝病毒感染相关性肝细胞癌与癌旁肝组织中的表达情况。结果表明SREBP1 蛋白在癌旁肝组织中主要于细胞质表达，而在肝细胞癌中则更多集中于细胞核内表达，这说明在肝细胞癌中原本无活性的SREBP1被激活后，从细胞质迁移至细胞核内进一步发挥其功能作用。并且SREBP1 蛋白在肝细胞癌中的表达均显著高于癌旁肝组织，以上与佟易凡等［15］部分研究结果基本一致。本实验研究结果还显示，SREBP1 蛋白的表达水平与肿瘤分化程度及远处转移或局部复发相关：在中低分化肝细胞癌组及有远处转移或局部复发肝细胞癌组中SREBP1 蛋白均呈现高表达趋势。以上提示SREBP1 蛋白可能参与肝细胞癌发生、发展的过程，并提示SREBP1 作为促进肝细胞癌发生、发展分子标记物的可能性。

肝细胞癌的发病目前被认为是由多种危险因素、多个步骤相互共同作用。在我国，约92%肝细胞癌患者与慢性乙型肝炎病毒感染相关［26］。有报道指出，慢性病毒性肝炎可引起肝内脂质合成及代谢紊乱，病毒的长期作用可促进肝脏炎症-纤维硬化-肝癌的疾病进展。越来越多的研究发现脂质从头合成与肿瘤的发生、发展密切相关［6，27］，肝脏又是人体脂质从头合成的中心部位，因此进一步探讨肝细胞癌中脂质从头合成的意义重大。在脂质从头合成过程中扮有重要角色的SREBP1 与乙肝病毒DNA 载量在乙肝病毒感染相关性肝细胞癌中的相关性研究还未见报道。本研究对SREBP1 与肝细胞癌乙肝病毒DNA 载量的关系分别进行统计分析显示：在乙肝病毒感染相关性肝细胞癌中，SREBP1蛋白在乙肝病毒DNA 高载量组（＞10³ IU/mL）中表达明显上调，提示SREBP1 蛋白表达与乙肝病毒复制活性存在相关性，为乙肝病毒感染相关性肝癌发生、发展相关机制探究提供新的研究方向。

综上，本研究显示，SREBP1 蛋白的表达与肝细胞癌存在相关性，且呈现高表达趋势，为后续肝细胞癌发生、发展相关的脂质代谢调节机制研究提供方向及理论依据。本研究结果还显示，SREBP1 蛋白表达与乙肝病毒复制活性存在相关性，为乙肝病毒感染相关性肝癌发生、发展相关机制探究提供新的研究方向。

作者贡献度说明：

邓慧孜：负责组织收集、病例资料收集和整理、免疫组化实验、切片染色结果判读及论文撰写；郑晶：负责实验设计、切片染色结果判读及文章审核校准；翁阳：负责切片染色结果判读及文章审核校准；魏尚：负责病例资料收集和整理。

所有作者声明不存在利益冲突关系。