miR-873 通过靶向Beclin1 基因调控细胞自噬促进支气管上皮细胞炎症与凋亡

陈 洁，林凌桑，李思广，莫濡冰，丁毅鹏，3

（1.海南医学院附属海南医院，海南 海口 570311；2.海南省人民医院全科医学科，海南 海口 570311；3.海南省人民医院呼吸与危重症医学科，海南 海口 570311）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种全球范围内常见的、可预防和治疗的疾病，其特征是持续的呼吸道症状和气流受限。该病病因复杂，主要由长期暴露于有害颗粒或气体所致，导致呼吸道和/或肺泡发生异常［1］。大量研究表明，氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、自噬和衰老参与了COPD 的发病机制，其中炎症反应和细胞死亡是慢阻肺最重要的致病因素［2，3］。慢性持续性炎症反应被认为是气道结构损伤、气道重塑和小气道阻塞的机制［4，5］。因此，针对炎症反应和细胞死亡的干预可能成为COPD 治疗的有效策略。

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18～22 个核苷酸的非编码小RNA，其与目标mRNA 的3'末端非编码区域或编码区结合，参与基因表达调控中的转录后抑制、蛋白质翻译阻止以及mRNA 降解增加等作用［6］。miRNAs 参与了多种生物学过程，包括调控细胞增殖、分化、凋亡、自噬等［7］。大量研究表明，miRNAs 参与调节与肺功能和炎症有关的多个基因的转录［8，9］。本研究将围绕miR-873 通过靶向Beclin1基因调控细胞自噬促进支气管上皮细胞炎症与凋亡这一新角度，阐述COPD 发生发展机制中miRNA 与自噬的关联，为深入理解COPD 的发生发展机制提供理论依据，并为临床干预COPD 进展提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂

人支气管上皮细胞16HBE 株购自中科院上海细胞库；胎牛血清、MEM 培养基、青霉素/链霉素和胰酶试剂购自Invitrogen；人白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、人白介素10（IL-10）和人肿瘤坏死因子α（TNF-α）的ELISA 试剂盒购于上海仁捷生物；BCA法蛋白质定量检测试剂盒、CCK-8 试剂盒和TUNEL 染色试剂盒购自碧云天生物公司；逆转录试剂盒（P312）和实时荧光定量PCR（Q331）购于南京诺唯赞生物；Beclin1 和LC-3 一抗购自Abcam 公司；二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；双荧光素酶报告基因购自上海吉玛基因（GenePharma）。

1.2 16HBE 细胞培养

16HBE 细胞在含有10%胎牛血清的MEM 培养基中进行培养，保持恒定的37 ℃和5%CO2气体条件。细胞每2～3 d 传一次代。

1.3 miR-873 mimic 转染16HBE 细胞

将16HBE 细胞以2 × 105个/孔的密度接种于6孔板，置于37 ℃和5%CO2培养24 h 后，miR-873 mimic（150 ng）使用100 μL 无血清MEM 稀释，制成终浓度5 nmol 的溶液。然后将其与12 μL HiPer-Fect 转染试剂混合，室温下静置10 min，形成转染复合物。将得到的转染溶液加入每个含有2 mL 培养基孔中。细胞在37 °C 下培养72 h 后进行后续实验。

1.4 qRT-PCR 检测

转染后的16HBE 细胞使用Trizol 试剂提取综RNA，用NanoDrop 2000 （美国赛默飞）评估提取RNA 的浓度和纯度。使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，在ABI 7500QPCR 仪上进行qPCR反应，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，62 ℃复性20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。分别以U6 和GAPDH 为内参，采用2-ΔΔct法计算miR-873 和Beclin1的表达量。miR-873 上游引物：5′-GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU-3′，miR-873 下游引物：5′-AGGAGACUCACAAGUUCCUGC-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；U6 下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′；下 游 引 物 ：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′；Beclin1上游引物：5′-CAGTACCAGCGGAGTAGTGA-3′；Beclin1 下游引物：5′-TGTGGAAGGTGGCATTGA AGA-3′。

1.5 CCK-8 法检测16HBE 增殖

将转染后的16HBE 和对照组细胞以1 000 个/孔的密度接种于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养48 h。然后向每个孔中加入10 μL CCK-8 试剂（注意设置对照孔和空白背景孔），在避光条件下37 ℃孵育2 h。使用分光光度计，在450 nm 波长下测量各孔的吸光度值。计算细胞增殖率时，采用以下公式：细胞增殖率 = （实验组吸光度值 - 背景值）/（对照组吸光度值 - 背景值）×100%。

1.6 ELISA 试剂盒检测

将转染后的16HBE 和对照组细胞以2 × 105个/孔的密度接种于6 孔板，置于37 ℃和5%CO2培养48 h，使用蛋白裂解液收集细胞上清备用。提前30 min 取出试剂盒平衡至室温。实验时，标准品加入100 μL 的标准品；空白对照孔加入100 μL 的蒸馏水；其余微孔中加入100 μL 的细胞上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，在450 nm 波长读取各孔的OD 值。

1.7 TUNEL 染色检测凋亡

将经75%酒精浸泡处理并晾干的载玻片放置于6 孔板中，以每孔2 × 105个细胞密度接种转染后的16HBE 细胞和对照组细胞。在37 ℃和5%CO2的培养条件下孵育48 h，随后用PBS 进行冲洗，并使用4% PFA 进行固定20 min。加入含有0.1%Triton X-100/0.1%钠柠檬酸的溶液孵育10 min，接着使用蛋白酶K 孵育10 min。将TdT 反应混合液滴加到样品中进行孵育1 h，该混合液包括TdT 酶、dUTP-biotin 标记物和缓冲液，孵育温度为37 ℃。最后，在样品中滴加streptavidin-荧光素进行避光室温孵育15 min。使用PBS 进行洗涤后，使用荧光显微镜观察样品并记录结果。

1.8 免疫荧光检测LC-3 表达

细胞处理方法参考TUNEL 染色，使用0.1%Triton X-100 打孔后，随后使用3%BSA 溶液室温孵育1 h 对细胞进行封闭处理。处理完毕后用PBS 进行冲洗，并加入LC-3 一抗于样品中4℃过夜孵育。第二天使用PBST 溶液4 次冲洗样品，每次5 min。然后在室温下加入荧光素标记的二抗，进行为期2 h的孵育。最后，使用DAPI 避光37 ℃染色15 min，再次洗涤后封片，置于荧光显微镜下观察样品并记录结果。

1.9 Western blot 检测Beclin1 表达

将转染后的16HBE 和对照组细胞以3×105个/孔的密度接种于6 孔板，置于37 ℃和5%CO2培养48 h，使用PBS 冲洗细胞一次，每孔加入150 μL 体积含1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液来裂解细胞，并使用BCA 法检测蛋白质的浓度。随后，使用5X SDS-PAGE loading buffer 将蛋白变性，并置于100 ℃水浴10 min。接着，蛋白经SDS-PAGE 电泳分离，并将其转移至硝酸纤维素膜（PVDF）上，置于5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入Beclin1一抗置于4 ℃过夜孵育。第2 天，回收一抗，PBST 清洗6 次，每次8 min。接着用二抗室温孵育蛋白条带1 h。回收二抗PBST 清洗后，通过ECL 显色技术进行信号检测。使用Quantity One 4.52 图像分析软件进行图像分析，以GAPDH 为内参计算蛋白的相对表达量。

1.10 双荧光素酶报告基因实验

本研究在293T 细胞中进行双荧光素酶报告基因实验，将Beclin1的野生型3'非翻译区（UTR）及其突变体插入到pMIR-RB-REPORT ™荧光素酶mRNA 表达报告载体中。接着，以5×104个/孔的密度将293T 细胞接种在6 孔板中，并使用Lipofectamine 2000 转染以下4 组：Beclin1-WT 和miR-NC、Beclin1-WT 和miR-873、Beclin1-MUT 和miR-NC、Beclin1-MUT 和miR-873。转染48 h 后，使用荧光分光光度计对Firefly 和Renilla 荧光素酶活性进行评估，并将其归一化为Renilla 荧光素酶活性。

1.11 统计学处理

使用统计软件GraphPad Prism 9.0 进行数据统计分析时，对于符合正态分布的计量资料，采用样本均值±标准差（±s）的方式进行表示。两组样品比较采用t检验，多组样品比较采用单因素方差分析。若数据符合正态分布且方差齐，则使用最小显著性差异法（LSD）进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett’s T3 法进行多重比较。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-873 抑制支气管上皮细胞增殖并促进其炎症反应

使用miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h，使用qRT-PCR 检测显示，与对照组相比，miR-873 mimic 转染组16HBE 细胞中miR-873 的mRNA 水平显著上升（3.44±0.10vs1.03±0.09，P＜0.001，t=24.42），见图1A，表明miR-873 mimic 成功转染16HBE 细胞。

图1 miR-873 上调促进支气管上皮细胞炎症Fig 1 Upregulation of miR-873 promotes inflammation in bronchial epithelial cells

使用miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h，使用CCK-8 检测16HBE 细胞活性。CCK-8 检测结果显示，与对照组相比，miR-873 mimic 转染组16HBE细胞从第二天开始增殖活性显著下降（第2 天：0.68±0.06vs1.16±0.170，P＜0.001，t=6.39；第3天：1.25±0.12vs1.84±0.05，P＜0.001，t=7.86；第4 天：1.81±0.13vs2.5±0.16，P＜0.001，t=9.10；第5 天：2.41±0.20vs3.40±0.12，P＜0.001，t=13.11），见图1B，表明miR-873 mimic 抑制支气管上皮细胞增殖活性。

使用miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h，ELISA 检测16HBE 细胞上清液中炎症因子IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 的表达。结果显示，与对照组相比，miR-873 mimic 转染组16HBE 细胞上清中炎症因子 IL-2（101.84±3.15vs15.36±1.422，P＜0.001，t=30.65）、IL-6（64.01±3.43vs11.19±2，21，P＜0.001，t=18.72）、TNF-α（163.93±8.01vs76.37±0.56，P＜0.001，t=31.04）的表达量显著上升，而IL-10（3.3±0.21vs19.72±1.26，P＜0.001，t=5.82）的表达量显著下降，见图1C，表明miR-873 mimic 诱导支气管上皮细胞炎症反应。

2.2 miR-873 促进支气管上皮细胞凋亡

TUNEL 染色结果显示，与对照组相比，miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h 明显提高16HBE 细胞的凋亡数量，见图2，表明miR-873 mimic 促进支气管上皮细胞凋亡。

图2 miR-873 上调促进支气管上皮细胞凋亡Fig 2 Upregulation of miR-873 promotes apoptosis in bronchial epithelial cells

2.3 miR-873 促进支气管上皮细胞自噬

免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h 明显降低16HBE 细胞中LC-3 染色，见图3，表明miR-873 mimic 抑制支气管上皮细胞发生自噬。

图3 miR-873 上调达抑制支气管上皮细胞自噬Fig 3 Upregulation of miR-873 suppresses autophagy in bronchial epithelial cells

2.4 miR-873 靶向结合Beclin1 并抑制其表达

使用miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h，qRT-PCR 检测显示miR-873 mimic 转染组16HBE细胞中Beclin1 的mRNA 水平显著下降，（0.41±0.08vs1.02±0.13，P＜0.001，t=21.67），见图4A。Western blot 检测显示，与对照组相比，miR-873 mimic 转染16HBE 细胞24 h 显著抑制Beclin1的蛋白表达（0.34±0.04vs0.78±0.09，P＜0.001，t=14.48），见图4B。上述结果说明miR-873 能够靶向调控Beclin1 的mRNA 和蛋白表达。

图4 miR-873 靶向结合Beclin1 抑制Beclin1 表达Fig 4 miR-873 binds to Beclin1 to inhibit its expression

Targetscan 数据库预测显示miR-873 与Beclin1的3'UTR 存在互补结合位点，见图4C。将含有Beclin1 3'UTR 结合位点的荧光素酶报告载体分别与miR-873 模拟物、miR-873 抑制剂共转染到16-HBE细胞中，培养24 h 共同测试荧光素酶活性，结果显示，Beclin13'-UTR-WT 和miR-873 的共转染显著抑制了荧光素酶活性（0.35±0.06vs1.03±0.26，P＜0.001，t=11.17），而Beclin1 3'-UTR-MUT 和miR-873 共转染对荧光素酶活性无明显影响，见图4D，表明Beclin1的3'UTR 与miR-873 存在结合位点。上述结果提示，miR-873 通过靶向结合Beclin1抑制其mRNA 和蛋白表达。

3 讨论

COPD 是一种常见的呼吸系统疾病，其发病机制非常复杂［2］。近年来，越来越多研究表明microRNA（miRNA）在COPD 进展中起到重要作用。研究证实，miR-21 可通过下调SATB1/S100A9/NF-κB信号通路诱导巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞活化，激活炎症反应，加剧COPD 的进展［10］。miR-223在COPD 患者和烟雾诱导的小鼠肺中高表达，通过调免疫细胞浸润介导COPD 的进展［11］。同时，miR-125a-5p 通过抑制Sp1/SIRT1/HIF-1a 通路抑制吸烟诱导的COPD/肺气肿肺上皮细胞衰老，从而加速COPD 的进展［12］。miR-150 对烟雾诱导的肺部炎症具有保护作用，能减弱香烟提取物诱导的气道上皮凋亡［8］。miR-125b 作为低氧调节的miRNA 通过调节呼吸道上皮细胞的凋亡诱导肺组织损伤，参与慢阻肺病的急性加重［9］。miR-126 促进炎症因子的释放，导致急性和慢性呼吸道炎症，引起可逆性气道限制、气道重塑和气道高反应性等病理生理变化，从而加重慢阻肺病患者的疾病严重程度［13］。本研究中发现miR-873 mimic 转染支气管上皮细胞16HBE 后，显著抑制其增殖活性，促进其凋亡，并诱导炎症因子IL-2、IL-6 和TNF-α 的分泌，同时抑制IL-10 的分泌。这些结果表明，miR-873 通过调控支气管上皮细胞的凋亡和炎症反应参与调控COPD进展。

自噬是一种保守的溶酶体降解途径，其特点是通过动态降解和再加工细胞成分来维持生理内稳态［14］。自噬作为一种细胞保护机制，可以保护多种疾病，尤其是肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病和感染性疾病。但过度激活的自噬会扰乱细胞内稳态并导致细胞死亡［15］。此外，有研究表明自噬在呼吸系统疾病的发病机制中也起到了一定作用，如COPD、哮喘和肺功能衰竭［16］。miRNA 作为调节基本生物学过程的重要因子之一，也参与了自噬的调控。例如，miR-214-3p 通过直接靶向ATG5 的3'UTR，调节HUVECs 细胞中ox-LDL 引发的自噬，从而参与了动脉粥样硬化的调控［17］。上调miR-93则通过抑制自噬增强IR 和TMZ 对脑胶质母细胞瘤的杀伤作用［18］。此外，上调miR-29c-3p 通过靶向调控FOXP1/ATG14 来抑制自噬增强顺铂对卵巢癌的杀伤作用［19］。在本研究中发现上调miR-873 能够显著减少支气管上皮细胞中LC-3 的表达，这表明miR-873 也具有抑制自噬的功能。

miRNA 是一类通过与mRNA 结合来影响靶基因表达的小分子RNA，参与调节细胞生命活动和发育等多个生理过程［20］。miRNA 通过与Argonaute蛋白结合形成RISC 复合物，在细胞质中与mRNA的3'非翻译区（3' UTR）相互结合。一方面，miRNA-RISC 复合物可以促进mRNA 降解，导致靶基因的表达量下降；另一方面，miRNA-RISC 复合物也可以抑制mRNA 的翻译过程，使靶基因的蛋白质合成减少［21］。Beclin1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对肿瘤发生、发展起着重要作用［22］。Bcl-2 家族蛋白Bcl-2、Bcl-xL 和Mcl-1 是抗凋亡蛋白，可以结合Beclin 1的Bcl-2 同源3（硼烷）结构域，对自噬发挥变阻器作用。在正常情况下，Beclin 1与Bcl-2 结合。当与Bcl-2 分离时，Beclin 1可以与Vps15、Vps34（也称为Ⅲ型PI3K）和其他蛋白如Ambra1 形成PI3KC3 复合物，以调节自噬的起始［23］。研究表明，miR-837-5p 可通过靶向抑制Beclin1的水平抑制肺癌细胞的生长、侵袭和血管生成，从而发挥抑制肺癌转移的作用［24］。本研究利用Targetscan 数据库预测和双荧光素酶报告基因验证了miR-873 与Beclin1的结合位点，并证实miR-873 mimic 能够靶向抑制Beclin1的mRNA 和蛋白表达。得出结论：miR-873 可能通过靶向抑制Beclin1基因，抑制支气管上皮细胞的自噬，促进支气管上皮细胞炎症和细胞凋亡，参与COPD 的发生和发展。

作者贡献度说明：

陈洁：双荧光素酶实验与写稿；林凌桑：细胞培养与转入；李思广：细胞增殖、凋亡与自噬检测；莫濡冰：RT-PCR 与western blot 检测；丁毅鹏：审稿与经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。