黎药海南地不容氧化克班宁对人乳腺癌MCF-7 细胞微管位点和微管蛋白的调控机制研究

肖 迪，闫彩凤，于晶涵，许声江，王先正，王正文

（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.海南省肿瘤医院肝胆胰外科，海南 海口 570000）

海南地不容（Stephania hainanensisH.S.Lo et Y.Tsoong）系防己科千金藤属植物，又名金不换、山乌龟，草质藤本，属海南特有植物。生于海南岛大山石缝、峭壁、乱石堆的半阴处或溪边丛林中［1］。海南地不容作为海南黎族的传统医药，块根入药。味苦，性寒，有小毒。具有清热解毒、抗菌抗炎、截疟、理气、止痛等功效。海南地不容中主要含有异喹啉型生物碱、阿扑啡型生物碱、原小檗碱型生物碱和吗啡型生物碱。这些生物碱具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥、抗血小板凝集等多种生物活性，用于治疗癌症、损伤和炎症［2，3］。课题组前期实验从海南地不容分离得到的阿朴菲类生物碱——单体化合物氧化克班宁（结构式见图1），具有抗乳腺癌活性，其敏感细胞株为MCF-7 细胞，IC50为16.66 μmol/L［4］。

图1 氧海南地不容氧化克班宁结构式Fig 1 The structural formula of oxocrebanine in Stephania hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong

微管是由α、β-微管蛋白异二聚体组成的圆柱形结构。通过抑制微管蛋白聚合或阻断微管的解聚，干扰微管的动态平衡，最终阻碍微管的正常功能导致细胞死亡。秋水仙碱是第一个确定的微管蛋白破坏剂［5］。目前进入临床试验的肿瘤血管阻断剂多为微管抑制剂，其中又多为作用于秋水仙碱位点的化合物［6］。Stathmin 是一种微管不稳定蛋白，它与α，β-微管蛋白异二聚体结合，调节微管动力。STAT3 与Stathmin 结合的位置是羧基末端区域，Stathmin 是STAT3 维持微管形态的直接靶点，STAT3 的过量表达，拮抗Sathmin 的微管解聚活性［7］。

前期研究发现，海南地不容氧化克班宁作为拓扑异构酶和微管蛋白的双重抑制剂，可同时干扰MCF-7 细胞的微管结构和动态平衡［8］。本论文进一步观察氧化克班宁对MCF-7 细胞微管网络的影响，通过对作用位点、信号通路等途径探讨氧化克班宁对微管网络的作用机制；在微观层面，通过检测氧化克班宁对微管调控蛋白的影响，进一步确定氧化克班宁促进微管解聚的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7 细胞由哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心提供；氧化克班宁（Oxocrebanine，98%）由海南医学院提供，紫杉醇购自上海源叶生物科技有限公司（货号B21695），秋水仙素购自碧云天生物科技有限公司（货号：ST1173），N，N，'-亚甲基双丙烯酰胺（EBI，2-iodo-iV-［2-［2-［2-［2- iodoacetyl］ethyl］acetamide）购自博奥森生物集团有限公司（货号：BA09167173），DMSO 购自天津市富宇精细化工有限公司（货号：20200605），RPMI-1640培养基购自大连美伦生物科技有限公司（货号：MA0215-Nov-17H），胰蛋白酶购自美国Sigma 药物公司（货号：20200603），胎牛血清购自广州翔博生物科技有限公司（货号：20201013）；电泳仪（型号：DYY-7C）、垂直电泳转印槽（型号：DYCZ-40D）购自北京六一生物技术有限公司，凝胶成像系统购自GE美国通用电气公司（型号：ImageQuant LAS500）。

1.2 方法

1.2.1 EBI 竞争法测定氧化克班宁竞争微管位点氧化克班宁给药浓度为8.33、16.66、33.32 μmol/L，秋水仙碱的终浓度为6.8 μmol/L，作用MCF-7 细胞48 h 后，用EBI（100 μmol/L）孵育2 h，空白对照组每孔加同体积RPMI 1640 培养基，收集细胞，加入RIPA 裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，提取蛋白。蛋白样品上样，低中高剂量组分别加入EBI，经 10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，于5%脱脂牛奶中封闭60 min 后抗体孵育。

1.2.2 分子对接 利用分子模拟软件AutoDock 进行分子对接研究。微管蛋白晶体结构从PDB 数据库（PDB：1SA0）下载。采用AutoDock 对晶体结构进行处理，包括提取配体、去除水分子、加氢、添加部分电荷和最小化能量。同时用ChemDraw 软件画出氧化克班宁结构图，然后利用PyMOL 软件构建待测化合物的三维结构，最小化能量后生成构象库。选择默认的对接参数将化合物对接到定义的对接点。

1.2.3 Western Blot 法测定 STAT3、PKA1、CAMK4、PKA 蛋白表达的变化 氧化克班宁给药浓度为8.33、16.66、33.32 μmol/L，秋水仙碱浓度为6.8 μmol/L，作用MCF-7 细胞48 h 后，提取蛋白。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，于5% 脱脂牛奶中封闭60 min，分别加入兔抗人STAT3、PKA1、CAMK4、PKA 抗体，4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入二抗，室温孵育60 min；TBST 洗涤3 次，加入ECL 发光试剂显影。

1.3 统计学处理

采用SPSS for Windows 21.0 软件对数据进行分析处理。多样本组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）和LSD 多重比较分析法进行。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化克班宁对微管位点的作用

以EBI 竞争实验确定氧化克班宁是否作用于微管蛋白的秋水仙碱位点，如图2 所示，EBI 与β-微管蛋白共价融合产生的加合物出现在分子量更小的区域（ctrl2），且随着氧化克班宁的浓度逐渐增高，加合物条带也随之消失，高浓度组出现的情况与秋水仙碱对照组相同。

图2 EBI 实验验证氧化克班宁靶向秋水仙碱位点Fig 2 EBI assay verified that oxocrebanine targeted colchicine sites

表1 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞β-tubulin 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 1 Effect of oxocrebanine on the expression level of βtubulin in MCF-7 cells （n=3，±s）

表1 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞β-tubulin 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 1 Effect of oxocrebanine on the expression level of βtubulin in MCF-7 cells （n=3，±s）

注：与空白对照组1 比较，**P＜0.01,与空白对照组2 比较，##P＜0.01。

组别空白组1空白组2质量浓度(μmol/L)00 β-tubulin adduct 0 0.67±0.03 0.50±0.05##氧化克班宁Colchicine 8.33 16.66 33.32 6.80 000 136.69 0.00 FP β-tubulin native 0.91±0.04 0.89±0.05 0.76±0.04**0.57±0.06**0.18±0.04**0.26±0.03**274.00 0.00

2.2 分子对接实验结果

推测氧化克班宁通过结合微管蛋白而靶向微管，使用AutoDock 软件研究氧化克班宁和微管蛋白（PDB：1SA0）融合及连接，评估氧化克班宁和微管蛋白的融合方式。结果显示，氧化克班宁可以占据微管蛋白的秋水仙碱位点，如图3 所示，氧化克班宁能够与Lys-254，Leu-255，Cys-241 和Leu-248 的残基形成疏水作用；氧化克班宁中的亚甲二氧基与Asn-258 形成氢键。证明氧化克班宁可能是一种与微管蛋白结合的抑制剂。

图3 氧化克班宁结构图及氧化克班宁与β-tubulin 对接位点展示Fig 3 Structure diagram of oxocrebanine and the binding sites of oxocrebanine and β-tubulin

2.3 氧化克班宁对人乳腺癌MCF-7 细胞微管关键蛋白的影响

2.3.1 氧化克班宁对MCF-7 细胞微管调控蛋白STAT3 的影响 实验结果如图4 和表2 所示，STAT3 的蛋白灰度值出现剂量依赖性降低的趋势（P＜0.01），表明给药氧化克班宁48 h 后，MCF-7 细胞内的STAT3 蛋白表达量降低。6.80 μmol/L 的Taxol 作用后，MCF-7 细胞内的STAT3 表达量显著减少（P＜0.01）。

表2 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞STAT3 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 2 Effect of oxocrebanine on the expression level of STAT3 in MCF-7 cells （n=3，±s）

表2 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞STAT3 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 2 Effect of oxocrebanine on the expression level of STAT3 in MCF-7 cells （n=3，±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01。

组别空白组Taxol 组氧化克班宁质量浓度(μmol/L)0 6.80 8.33 16.66 33.32 FP STAT3 1.13±0.04 0.69±0.02**0.93±0.03**0.71±0.04**0.56±0.05**102.84 0.00

图4 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞STAT3 表达水平的影响Fig 4 Effect of oxocrebanine on the expression level of STAT3 in MCF-7 cells

2.3.2 氧化克班宁对MCF-7 细胞Stathmin 调控蛋白PKA1 和CAMK4 的影响 实验结果如图5、6 和表3，氧化克班宁8.33、16.66、33.32 μmol/L 作用细胞48 h，细胞内PKA1 蛋白表达水平均出现明显降低（P＜0.05）。各剂量组CAMK4 蛋白表达水平均出现了显著下降（P＜0.01）。6.80 μmol/L 的Taxol作用后，MCF-7 细胞内的PKA1 和CAMK4 蛋白表达量同样显著减少（P＜0.01）。

表3 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞PKA1 和 CAMK4 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 3 Effect of oxocrebanine on the expression level of PKA1 and CAMK4 in MCF-7 cells （n=3，±s）

表3 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞PKA1 和 CAMK4 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 3 Effect of oxocrebanine on the expression level of PKA1 and CAMK4 in MCF-7 cells （n=3，±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01。

组别PKA1 CAMK4空白组Taxol 组氧化克班宁质量浓度(μmol/L)0 6.80 8.33 16.66 33.32 FP 1.46±0.05 0.92±0.05**1.31±0.03*1.15±0.06**0.49±0.04**123.31 1.01±0.04 0.73±0.03**0.85±0.03**0.66±0.04**0.43±0.02**136.69 0.00 0.00

图5 氧化克班宁对MCF-7 细胞PKA1 的影响Fig 5 Effect of oxocrebanine on the expression level of PKA1 in MCF-7 cells

图6 氧化克班宁对MCF-7 细胞CAMK4 的影响Fig 6 Effect of oxocrebanine on the expression level of CAMK4 in MCF-7 cells

2.2.3 氧化克班宁对MCF-7 细胞Stathmin 调控蛋白PKA 的影响 实验结果如图7 和表4，不同剂量的氧化克班宁（8.33、16.66、33.32 μmol/L）作用于MCF-7 细胞48 h，均可降低PKA 蛋白表达水平（P＜0.01）。Taxol 组PKA 蛋白表达水平出现相同下降趋势（P＜0.01）。

表4 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞PKA 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 4 Effect of oxocrebanine on the expression level of PKA in MCF-7 cells（n=3，±s）

表4 氧化克班宁对乳腺癌MCF-7 细胞PKA 表达水平的影响（n=3，±s）Tab 4 Effect of oxocrebanine on the expression level of PKA in MCF-7 cells（n=3，±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01。

组别空白组Taxol 组氧化克班宁质量浓度(μmol/L)0 6.80 8.33 16.66 33.32 FP PKA 1.05±0.02 0.85±0.06**0.89±0.06**0.71±0.04**0.47±0.04**63.19 0.00

图7 氧化克班宁对MCF-7 细胞PKA 的影响Fig 7 Effect of oxocrebanine on the expression level of PKA in MCF-7 cells

3 讨论

海南地不容为临床常用黎药，在当地医院用于乳腺癌（乳石痈）的治疗［1］。本课题组前期实验发掘出抗乳腺癌活性单体化合物氧化克班宁，具有双重抑制微管蛋白和拓扑异构酶作用，本实验研究了氧化克班宁引起人乳腺癌MCF-7 细胞有丝分裂灾难的微管调控机制。

微管具有重要的生物学功能，如参与染色体分离，细胞内运输和维持细胞形态［9］。微管是由非共价微管蛋白异质二聚体（α-tubulin 和β-tubulin）组成，在关键的细胞事件特别是在有丝分裂中发挥重要作用，所以微管被认为是抗癌药物设计的重要靶点［10］。微管靶向药物是各种类型癌症必不可少的化疗药物，微管破坏剂药物如紫杉醇、长春碱和长春新碱临床上可用于治疗多种癌症。微管破坏剂（如长春碱）通常在长春花生物碱位点与微管蛋白结合，而秋水仙碱在微管蛋白二聚体的亚基内界面发挥其生物效应［11］。秋水仙碱结合位点位于微管α和β 亚基的连接处，与α 亚基上的GTP 结合位点相邻。有学者认为秋水仙碱结合在β 微管蛋白上导致原本的直型构象弯曲，秋水仙碱和α 微管蛋白间形成了空间位阻，因而影响微管聚合［12，13］。作为新型微管抑制剂的氧化克班宁，可以选择性地调节微管蛋白的活性，从而对MCF-7 细胞产生显著的细胞毒性，而对正常细胞的细胞毒性较小［14-17］。分子对接结果进一步证明，氧化克班宁可以结合微管蛋白。因此，氧化克班宁结合在微管蛋白秋水仙碱位点扰乱微管蛋白聚合，干扰MCF-7 细胞的有丝分裂，从而导致MCF-7 细胞死亡。

EBI 试剂是一种特殊的构化剂，它与（3-微管蛋白质）的Cys239 和Cys354 残基交联而成。在此基础上，β-tubulin 加合物的转移速率明显高于β-tubulin 自身，在其相对分子质量较小的部位形成β-tubulin-EBI 加合物条带。在微管蛋白抑制剂占据秋水仙碱位点后，β-tubulin 加合物的生成受到抑制［18］。然而MCF-7 细胞经氧化克班宁或秋水仙碱处理后，再添加EBI 试剂，β-tubulin-EBI 加合物的形成受到抑制，表明氧化克班宁与微管蛋白的秋水仙碱位点相互作用，EBI 结合物条带随着氧化克班宁的浓度升高，加合物条带不再出现，说明氧化克班宁浓度越高，与微管蛋白的秋水仙碱位点结合越紧密，越容易加强微管动力。

Stathmin 通过结合微管蛋白二聚体来抑制微管蛋白，Stathmin 的微管不稳定活性可被细胞表面受体激酶级联和细胞周期蛋白依赖激酶所关闭。细胞刺激可以通过酪氨酸磷酸化激活STAT 家族成员，诱导其二聚体化，激活的STAT3 从细胞质转位到细胞核，介导许多STAT3 应答基因的转录。STAT3 在癌细胞中常过表达，并作为促进生长和抗凋亡基因的转录因子，被认为是癌症进展的关键因素［19］。由于氧化克班宁可作用于微管蛋白秋水仙碱位点，又可增强微管动力，因此推测氧化克班宁发挥微管蛋白抑制作用可能是通过促微管解聚因子而完成。

据报道，STAT3 可通过与Stathmin 末端结合来调节微管功能，且Stathmin 过表达对STAT3 活性无显著影响，但若STAT3 的表达增高可拮抗非磷酸化Stathmin 引起的微管解聚活性［20］。氧化克班宁通过阻断STAT3 的积累并抑制其活性，从而增加Stathmin 的活性，加快微管解聚的进程；通过调节PKA1、PKA 和CAMK4 蛋白水平，促进Stathmin 激活通路，进而破坏微管网络，造成有丝分裂阻滞。STMN1 丝氨酸位点可被PKA1、CAMK4 和PKA 蛋白磷酸化。其中，Stathmin 表达水平的变化影响了RhoA/ROCK 通路的激活，进而调节了微管的变化。氧化克班宁可通过抑制MCF-7 细胞中STAT3、PKA1、CAMK4 和PKA 蛋白的表达水平，来促进微管动力的关键因子Stathmin，通过调节微管相关蛋白来促进微管解聚，使纺锤体无法形成，最终造成MCF-7 细胞有丝分裂灾难。

作者贡献度说明：

肖迪：完成实验；闫彩凤：负责文章撰写；于晶涵：对数据进行统计分析；许声江、王先正、王正文：对手稿进行最终审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。