离子色谱法测定依达拉奉注射液中亚硫酸盐

王春霞，盖成，王子梦，苗会娟，马宁

（河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200）

依达拉奉，化学名3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉-5-酮，是以苯肼和乙酰乙酸乙酯为原料合成的吡唑啉酮类化合物，具有强大的自由基清除作用，可作用于脑梗死前期，抑制脑水肿、缩小脑梗死区、减轻神经症候群的发作、抑制迟发性神经细胞的死亡及脑缺血性脑血管障碍的出现，保护脑组织的结构和功能[1-4]。相关研究证实依达拉奉注射液对急性脑梗死患者的神经功能缺损起到一定的的改善作用[5‒7]。

依达拉奉注射液辅料中含有亚硫酸钠，亚硫酸盐对于人体有害，如果合成过程中或者制剂所用辅料中添加了亚硫酸盐，质量检测标准中需要设置对亚硫酸盐的残留量检查项，依达拉奉注射液的指定质量标准为YBH09282009，标准规定采用对样品进行回流后滴定的方法测定亚硫酸盐的含量，此方法样品处理过于复杂，且蒸馏的终点难以把握，容易出现蒸馏未完成、有效成分损失等问题，且专属性差，准确度不高。离子色谱(HPIC)测定阴离子的原理在于，当水样随淋洗液通过阴离子分离柱时，由于各组分对低容量强碱性阴离子树脂的亲和力不同而分开，被分离的阴离子在流经抑制柱(强酸型阳离子树脂)时被转变为高电导的酸，淋洗液则转变为弱电导的酸或水，用电导检测器测量生成的酸型阴离子[8‒11]。笔者采用离子色谱法测定依达拉奉注射液中亚硫酸盐含量，专属性好，精密度高，数据准确。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效离子色谱仪：DIONEX ICS-6000 型，美国赛默飞科技公司。

电子分析天平：XS105型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

依达拉奉注射液：批号分别为210603、210604、210605、210811、210812、210813、211024、211025、211026，规格均为20 mL，依达拉奉质量为30 mg，某药企提供。

亚硫酸钠溶液标准物质：20 μg/mL(以亚硫酸根离子计)，产品编号BW73875-3，北京谱析标准技术有限公司。

硫酸钠溶液标准物质：1 000 μg/L，产品编号BW62875，北京谱析标准技术有限公司。

甲醛溶液：质量浓度37%，编号R00005-3，北京谱析标准技术有限公司。

氢氧化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：(1) Dionex IonPac AS11-HC 柱(250 mm×4.6 mm，7.5 μm，美国戴安科技有限公司)阴离子交换分析柱；(2) AG23-HC阴离子交换保护柱；柱温：25 ℃；淋洗液：15 mmol/L氢氧化钾溶液，流量为1.0 mL/min；检测器：电导检测器；检测器温度：30 ℃；抑制器：自动再生抑制模式；抑制电流：40 mA；进样体积：25 μL。

1.3 溶液制备

空白溶液：精密量取甲醛2.7 mL，置于1 000 mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀，作为空白溶液。

空白辅料溶液：分别称取除亚硫酸钠外的其它辅料(包括盐酸半胱氨酸)适量，按照依达拉奉注射液配方，用空白溶液同法制备。

系统适用性溶液：精密量取硫酸钠溶液标准物质和亚硫酸钠溶液标准物质各2 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用空白溶液稀释至标线，摇匀。

亚硫酸钠系列标准工作溶液：精密量取亚硫酸钠溶液标准物质0.01、0.1、1、5、5、5、5 mL，分别置于100、100、100、200、100、50、25 mL容量瓶中，用空白溶剂稀释至标线，摇匀。

亚硫酸钠对照品溶液：精密量取亚硫酸钠溶液标准物质5 mL，置于200 mL容量瓶中，用空白溶液稀释至标线，摇匀。

硫酸钠对照品溶液：精密量取硫酸钠溶液标准物质2 mL，置于100 mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻线，摇匀。

依达拉奉注射液样品溶液：精密量取依达拉奉注射液1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用空白溶液稀释至刻线，摇匀。

1.4 实验步骤

取亚硫酸盐对照品溶液和依达拉奉注射液样品溶液，按照1.2色谱条件进样分析，记录色谱图峰面积，按照外标法计算样品中亚硫酸盐的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

离子色谱法测定亚硫酸盐，一般会选用Dionex IonPac AS11-HC或者Dionex IonPac AS23-HC色谱柱[12]，选用Dionex IonPac AS11-HC 色谱柱时，一般采用氢氧化钾溶液或者氢氧化钠溶液作为淋洗液[13‒14]，而Dionex IonPac AS23-HC 色谱柱常用于淋洗液中含有碳酸根的系统中。实验考察了以上两种色谱柱，结果表明，采用Dionex IonPac AS11-HC 色谱柱检测时，各色谱峰的分离度良好，且色谱峰对称性好，故选择Dionex IonPac AS11-HC 色谱柱。依达拉奉分子进入离子色谱柱后难以洗脱，会缩短色谱柱的使用寿命，故用C18填料的小柱过滤依达拉奉注射液样品溶液，以除去依达拉奉大分子，可以有效地保护色谱柱。

2.2 淋洗液浓度的选择

在离子色谱系统中，淋洗液的组成、质量浓度及流量都是影响测定结果至关重要的因素。其中，淋洗液的浓度与被测离子的色谱保留时间息息相关[15‒16]。选用氢氧化钾溶液作为淋洗液，调整其浓度，考察不同浓度的淋洗液对于检测结果的影响。结果表明，氢氧化钾溶液浓度为10 mmol/L时，色谱峰有前延现象，淋洗液浓度为15、20 mmol/L 时，色谱峰形状规则，且能与其它杂质色谱峰峰很好的分离。在保证分离效果的前提下尽量选择低浓度的溶液，故选择氢氧化钾溶液的浓度为15 mmol/L。

2.3 柱温的选择

在离子色谱系统中，柱温对于被测组分的色谱保留时间和色谱峰形有很大影响，不同的离子在柱温变化时呈现出不同的变化趋势。分别柱温为20、25、30、35 ℃进行试验，记录色谱图，结果表明，柱温为25 ℃时色谱峰峰形对称性好，且系统中各色谱峰之间的分离度好，色谱保留时间适宜。故选择柱温为25 ℃。

2.4 稀释液的选择

实验采用质量分数为0.1%的甲醛溶液作为保护液(稀释液)，一方面，甲醛可与亚硫酸盐形成复合物，使其不被氧化，从而保证测量结果的准确性。而甲醛浓度太高，容易被抑制器的电流电离而产生信号，也会影响测定的准确性。故需要优化甲醛溶液的浓度。分别实验考察了0.1%的甲醛和1%的甲醛溶液作为保护液时的色谱分离效果。结果显示，采用1%的甲醛作为保护液时，甲醛被抑制器电离后，在色谱图中呈现一个较大的拖尾色谱峰，影响亚硫酸根离子的测定结。而采用0.1%的甲醛溶液作为保护液时，亚硫酸根离子的测定不受影响。故选择使用0.1%的甲醛溶液作为保护液。

2.5 专属性

取空白溶液、辅料空白溶液、亚硫酸钠对照品溶液、依达拉奉注射液样品溶液和硫酸钠对照品溶液分别注入离子色谱仪，色谱图如图1 所示。结果表明，亚硫酸根离子和硫酸根离子能有效分离，且色谱条件对样品分析无干扰。

图1 离子色谱图

2.6 线性关系

精密量取亚硫酸钠系列标准工作溶液各25 μL，分别按1.2 色谱条件进行测定，记录色谱图，以亚硫酸钠质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.098 09x-0.088 74，r=0.999 8，亚硫酸钠的质量浓度在0.1～200 μg/mL范围内线性关系良好。

2.7 定量限及检出限

精密量取亚硫酸根对照品溶液，逐级稀释后测定，直至信噪比约为10，对应的亚硫酸根对照品溶液的质量浓度即为亚硫酸根定量限。精密量取定量限试验最低浓度溶液3 mL，置于10 mL 容量瓶中，用空白溶液稀释至标线，摇匀，取该溶液25 μL，注入离子色谱仪，连续进样6 次，记录色谱图，计算方法的检出限[17‒19]。实验结果表明，该方法亚硫酸根离子定量限为0.072 μg/mL，检出限为0.027 μg/mL。

2.8 样品加标回收试验

精密量取依达拉奉注射液样品1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用空白溶液稀释至标线，摇匀，平行制备9份依达拉奉注射液样品溶液，每3份为一组，每组分别加入1 000 μg/mL的硫酸钠溶液标注物质0.8、1.0、1.2 mL，并用空白溶剂稀释至标线，摇匀；精密量取上述溶液注入离子色谱仪，记录色谱图；计算亚硫酸根离子的回收率和相对标准偏差，结果见表1。由表1 可知，亚硫酸盐的回收率为98.5%～100.6%，相对标准偏差为0.7%(n=9)。该方法满足验证要求，精密度、准确度良好。

表1 样品加标回收试验结果

2.9 稳定性试验

取新鲜配制的亚硫酸钠对照品溶液(质量浓度为20 μg/mL)和依达拉奉注射液加标样品溶液，在室温下放置2、4、6、8 h后，精密量取不同放置时间的上述溶液注入离子色谱仪，记录色谱图，色谱峰峰面积测定值见表2。由表2可知，亚硫酸钠对照品溶液及依达拉奉注射液加标样品溶液放置8 h时，亚硫酸根离子的色谱峰面积相对标准偏差分别为0.4%和0.2%，表明亚硫酸根离子在水溶液中相当稳定。

表2 亚硫酸钠对照品与依达拉奉注射液加标样品稳定性试验结果

2.10 样品测定

取依达拉奉注射液样品9 批，按照原标准中蒸馏后剩余滴定的方法和离子色谱法两种方法分别测定，结果见表3。由表3 可知，原标准方法测定的亚硫酸盐的含量均低于离子色谱法测定的含量，说明原标准中存在反应不完全或者降解的现象。经计算，在95%的置信区间内，不同批号样品测试的F值均小于F0.05(5,5)，说明两种方法的精密度相同；t检验中，P值均小于0.01，说明两种方法的准确度存在显著性差异。根据加标试验结果可以确定，离子色谱法测定结果准确度较高。

表3 亚硫酸盐质量浓度检测结果

3 结语

建立了离子色谱法测定依达拉奉注射液中的亚硫酸盐的方法，通过筛选色谱柱和淋洗液、调整淋洗液的浓度、柱温等条件，获得了最佳离子色谱检测条件。与原标准中的依达拉奉注射液样品溶液先回流后进行剩余滴定的方法相比，省略了繁琐的样品处理过程，避免了原检测方法中被测成分的反应不完全或者降解现象。离子色谱法专属性好，灵敏度高，耐用性好，测定结果准确可靠，为药品中亚硫酸盐的测方法定提供了新的选择。