超高效液相色谱--静电场轨道阱高分辨质谱法筛查水产养殖用投料中36种兽药

肖曼，钟仕花，张微，吴丹，徐媛原，张杨，张兵

（深圳市质量安全检验检测研究院，广东深圳 518000）

近年来，我国水产养殖行业正在朝着高速度、集约化的方向发展，随之而来的问题是在养殖过程中病害频发，需要大量使用各类药物[1]。水产养殖用投入品主要包含饲料添加剂、鱼药、水环境投入品等[2]。目前市面上存在部分既不是兽药又不归类于饲料添加剂的水环境投入品，标签上冠以“非药品”的描述或字眼，例如声称可改变和调节养殖环境如养殖水、底泥的微生态制剂[3]、水质改良剂及底质改良剂，能预防各种水生动物疾病并改善养殖动物健康的中草药制剂[4]等。水产用非药品与兽药（渔用药品）的不同之处在于非药品是未按照药品审批程序进行研发、试验、审核，并获得相关审核机关赋予的药品批准文号的一类水产养殖投入品[5]。理论上，这类产品仅用于改善水产养殖环境，助力于水产养殖业的发展，并不会对水生动物的生长、发育和繁殖因其药物毒性造成质量和安全方面的问题[6]，但是市面上一些杀虫药物也被包装成“非药品”，甚至存在违规使用禁限用药物，冠以“非药品”等字眼和标签的市场乱象[7]。农业农村部渔业渔政管理局、农业农村部在2020～2021 年相继出台了相关通知和公告，要求加强对水产养殖用投入品及物质的监管，严厉打击故意以所谓“非药品”等名义来从事生产、经营、使用假兽药的工作从而逃避兽药监管的违法行为[8‒9]。因此，建立高效、便捷、准确筛查水产养殖用非药品类投料中多种兽药的方法尤为必要。

利用高分辨质谱的全扫描模式与二级质谱信息相结合的质谱分析方法，在实现高通量筛查多种物质时主要采用的高分辨质谱技术包含四极杆飞行时间质谱法[10]及轨道阱高分辨质谱法，研究对象有蜂蜜[11]、蒸馏谷物[12]、水产品[13]、渔用饲料[14]等，利用高分辨质谱技术对研究对象中的磺胺类药物[15]、硝基咪唑类药物[16]、抗菌类药物[17]残留进行检测。

笔者利用超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪中正、负离子全扫描模式获取母离子信息，利用二级质谱获取离子碎片信息，建立了36种兽药的样品预处理方法和色谱与质谱特征数据库，结合保留时间进行定性，利用一级质谱的精确质量数和保留时间进行定量。利用基质添加试验对该方法进行验证，在添加质量浓度水平相对较低的情况下可保证较理想的测定结果。通过建立Waters PRIME HLB 固相萃取柱净化-超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪测定的方法，可快速、准确地对水产养殖用非药品类投料中多种兽药同时进行定性和定量检测，满足大量水产养殖用非药品类投料中多种兽药的快速筛查和定量的需求，对现有国家标准提供方法参考与补充。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪：Ultimate 3000 型超高效液相色谱仪和QExactive 型静电场轨道阱高分辨质谱仪联用，配有HESI-II 电喷雾电离源、Xcalibur 控制软件、Trace Finder数据处理软件，美国赛默飞世尔科技公司。

固相萃取柱：PRIME HLB柱（6 mL/200 mg），美国沃特世公司。

天平：XS105DU 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

乙腈：色谱纯，德国默克公司。

无水磷酸氢二钠：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司。

乙二胺四乙酸二钠：分析纯，广州化学试剂厂。

柠檬酸：分析纯，山东西亚化学股份有限公司。

甲酸：色谱纯，阿拉丁试剂上海有限公司。

36 种兽药标准物质：硝基咪唑类药物（羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑、羟基异丙硝唑、羟基甲硝唑、噻苯哒唑、奥硝唑、替硝唑）、苯并咪唑类（阿苯哒唑亚砜、阿苯达唑砜、羟基甲苯咪唑、芬苯达唑、氟苯达唑）；抗病毒类药物（金刚烷胺）、磺胺类药物（磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、甲氧苄啶）、酰胺醇类药物（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考），质量分数均大于98%，德国DR公司。

水产养殖投料样品：底质改良剂、水质改良剂、消毒剂、杀菌杀虫和杀藻剂、中草药制剂。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：分别称取无水磷酸氢二钠14.2 g、乙二胺四乙酸二钠3.4 g、柠檬酸19.2 g，用水溶解，混合均匀，定容至1 000 mL。

36种兽药标准储备液：质量浓度均为1 mg/mL，分别准确称取10 mg按纯度100%折算质量的36种兽药的标准物质，用甲醇完全溶解并定容至10 mL。

36种兽药混合标准工作液：各组分质量浓度均为10 μg/mL，分别吸取对应标准储备液0.1 mL于同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL。

1.3 样品预处理

称取水产养殖投料样品2.50 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液5 mL，涡旋混匀，加10 mL 80%（体积分数，下同）乙腈水溶液（含体积分数为0.2%的甲酸）作为提取液，置于多管涡旋振荡器上混匀5 min，超声提取5 min，在高速冷冻离心机上以9 000 r/min离心5 min，取出上清液待用。准取吸取上清液3.5 mL直接通过PRIME HLB 固相萃取柱净化，控制过柱流速在1 滴每秒，收集滤液。从滤液中移取2.5 mL至15 mL带刻度离心管内，于40 ℃水浴下氮吹至液面低于0.5 mL。用10%（体积分数）乙腈水溶液复溶，定容至1.00 mL，充分溶解残留液后，过0.22 μm滤膜后待测。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱仪

色谱柱：Accucore™ RP-MS 型柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm，美国赛默飞世尔科技公司)；柱温：30 ℃；流动相：（A）0.03%（体积分数）氨水溶液，（B）0.03%（体积分数）氨水-乙腈溶液，（C）0.1%（体积分数）甲酸溶液,（D）0.1%（体积分数）甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1，流量为0.3 mL/min；进样体积：5 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱仪

可加热的电喷雾离子源（HESI-II）；离子传输管温度：320 ℃；毛细管电压：3 500 V（正离子模式），3 200 V（负离子模式）；气化温度：400 ℃；鞘气：氮气，压力为0.276 MPa；辅助气：氮气，压力为0.068 9 MPa；一级质谱驻留时间：100 ms；二级质谱驻留时间：50 ms；一级全扫描范围：m/z120～1 200；分辨率：70 000；扫描模式：Full scan+ddms2（一级全扫描+自动触发二级质谱扫描）；二级分辨率：17 500；碰撞裂解气：氮气，碰撞能量为20、40、60 eV[15]。

1.5 定性与定量方法

采集100 ng/mL 的36 种兽药混合标准溶液，在优化的液相色谱和质谱条件下获取的保留时间、母离子精确质量数及其加和方式，并采集经三个碰撞能量级别（碰撞能量分别为20、40、60 eV）条件下获取的二级碎片离子信息，汇总并建立36种兽药的色谱和质谱信息，见表2。样品按1.2方法进行样品预处理，利用Full MS/dd-MS2（TopN）模式采集数据，比对数据库中目标化合物的保留时间、二级碎片离子信息和质量误差等信息进行定性筛查。采用外标法，通过母离子精确质量数对筛查出化合物，并进行定量。

表2 36种兽药的色谱和质谱信息

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

研究发现，采用乙腈体系可以获得较低的背景值[10]。在正离子模式（HESI+）下，通过比较目标化合物在以下3种不同的流动相组成下的色谱响应值及色谱峰形：（1）水-乙腈，（2）0.1%甲酸溶液-乙腈，（3）0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸-乙腈溶液，以实现最大的分辨率及灵敏度。比较发现，在流动相中添加适量甲酸可以提高目标化合物的离子化程度，且色谱峰形更好，目标化合物色谱响应值更大。因此正离子模式下采用0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相。以相同原则筛选负离子模式（HESI-）流动相，最终选定0.03%氨水溶液和0.03%氨水-乙腈溶液。将经过空白基质提取液稀释的100 μg/kg 36种兽药标准物质通过设定比例梯度洗脱，获得的36种兽药的提取离子色谱图见图1。

图1 空白基质提取液添加36种兽药标准物质的提取离子色谱图

2.2 样品预处理条件优化

乙腈与水能够互溶，可以增强样品的提取效率，是兽药分析常用的提取剂，且使用乙腈作为提取剂时共提物中干扰物质较少。向提取剂中适当添加甲酸可以增加提取效率，减少色谱图峰形拖尾的现象[18]，但在负离子模式下若甲酸含量过高，色谱峰形易受影响[19]。

试验比较了乙腈、80%乙腈水溶液、80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）的提取效果。结果显示，用单一有机试剂乙腈提取时，磺胺类药物提取效果不佳；而采用80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）作为提取剂时目标化合物响应值较高。因此选择80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）作为提取溶剂。

目前样品净化主要采用分散固相萃取及固相萃取等方式去除提取液中的杂质。试验比较了安捷伦QuEChERS 盐包（4 g 硫酸钠+1 g 氯化钠）、安谱QuEChERS盐包（600 mg无水硫酸镁+100 mg PSA+40 mg C18）、Waters PRIME HLB 固相萃取柱（6 mL 200 mg）的提取效果，结果表明，使用QuEChERS盐包后，相较于过Waters PRIME HLB 柱净化的方式，部分目标物的响应值较小，且色谱峰形较差。因此实验采用PRIME HLB 柱固相萃取的方式进行样品净化。

2.3 线性范围与检出限、定量限

以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。36种兽药在质量浓度2.5～100 μg/mL（酰胺醇类药物）、12.5～100 μg/mL（其它药物）范围内，相关系数均大于0.99。将信噪比大于3 对应的样品中目标物的质量分数作为方法检出限，将信噪比大于10对应的样品中目标物的质量分数作为定量限，得该方法酰胺醇类药物检出限为10 μg/kg，定量限为20 μg/kg；其它药物检出限为50 μg/kg，定量限为100 μg/kg。36种兽药质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限见表3。

表3 36种兽药质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限、平均回收率及相对标准偏差(n=6)

2.4 样品加标回收试验

用空白基质添加酰胺醇类药物（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考）低、中、高3 个质量浓度水平（目标物质量分数分别为10、20、100 μg/kg），其余药物添加质量浓度水平为50、100、200 μg/kg，进行样品加标回收试验，每个浓度水平平行测定6个样品，用空白基质添加标准曲线对样品进行定量，测定数据及计算结果列于表3。由表3可知，36种兽药的平均回收率为59.9%～118.3%，相对标准偏差为1.7%～14.5%。表明该方法的目标物回收率及精密度良好，准确性高，满足实验室质量控制的相关要求。

3 结语

建立了水产养殖用非药品类投料中36 种兽药的超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱筛查与确证方法。由于水产养殖投料所含成分较为复杂，因此在样品预处理部分采用固相萃取法净化，结合高分辨质谱技术高选择性、高精确性的优势，建立多组分筛查的分析方法。该法利用一级质谱精确质量数、二级质谱碎片离子信息和液相色谱保留时间等参数，可快速、准确地对水产养殖用非药品投料中多种兽药同时进行定性和定量检测。满足大量水产养殖用非药品投料中多种兽药的快速筛查和定量的需求，可对水产养殖用非药品投料中多种兽药的检测提供方法参考与补充。