高效液相色谱法同时测定益肾保健酒中9种有效成分

陈彦和，胡杨，李先芝，2，毛琼丽，刘洋，石豪，严玲，朱艳

（1.劲牌有限公司，湖北大冶 435100；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435100）

我国拥有悠久的酒文化和中医药文化，保健酒是我国传统酒文化和中医药文化有机结合的产物，迄今已有3 600多年的历史，是我国酒文化历史长河中的重要组成部分[1]。保健酒是以白酒为基础，通过加入可食用或者药食两用的辅料进行加工、调配而成具有某些保健功能的一种配制酒。现代医学表明，酒精的过量摄入会对肝肾造成损伤[2‒3]，但保健酒中的抗氧化物质对人体的肝肾有一定的保护作用[4‒5]，基于此，保健酒日趋得到消费者的青睐。董琪等[6]选取桑椹、桑叶、桑枝和亳桑皮4种原料，制备了亳桑保健酒。那广宁等[7]以苦瓜汁与苹果菠萝混合果汁为原料，选用酿酒酵母及植物乳杆菌作为发酵菌种定向发酵苦瓜保健酒，抗氧化试验结果表明，苦瓜保健酒有一定的抗氧化活性，且其抗氧化化性与皂苷质量浓度呈正相关。李大成等[8]以新鲜甘蔗皮为主要功能保健原料，用浸泡法生产具有抗氧化活性的甘蔗皮保健酒。陆世广等[9‒11]对中国劲酒进行了研究，研究结果发现中国劲酒具有缓解疲劳、增强免疫力、缓解肾阳虚证等功效。

益肾保健酒是一款在研产品，以清香型白酒为基酒，以当归、肉桂、淫羊藿等3味药材为原料，按照一定配比，经过数字化提取精制而成。当归是一种常见的具有补血活血、调经止痛、润肠通便功效的中药材[12]，现代研究表明，当归中的主要成分为有机酸类、苯酞类、多糖类、黄酮类等[13‒15]。此外，也有大量研究发现，当归在保肝护肾方面有显著效果[16‒17]。肉桂是主要生长于热带和亚热带地区的一种药食两用的植物，其主要成分为挥发油、多酚类、糖苷类、萜类、黄酮类等[18‒20]。研究表明肉桂在改善肾阳虚方面有显著效果[21‒22]。淫羊藿苷等黄酮类是淫羊藿药材中的主要化合物，淫羊藿中的黄酮类成分对肾脏具有保护效果[23‒24]。

目前，关于益肾保健酒的研究较少。笔者建立高效液相色谱法测定益肾保健酒中5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯9种有效成分含量，以期为益肾保健酒的质量控制提供技术参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：UltiMate 3000型，美国赛默飞世尔科技公司。

数控超声波清洗仪：SK1200H 型，上海科导超声仪器有限公司。

电子分析天平：SQP 型，感量为0.001 mg，德国赛多利斯公司。

超纯水仪：PURELAB classic UV 型，英国ELGA公司。

乙腈、磷酸：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

甲醇、乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

益肾保健酒样品：5批，劲牌有限公司。

9种化合物对照品：相关信息见表1。

表1 9种化合物对照品信息

实验用水：GB/T 6682规定的一级水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Sepax HP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，苏州赛分科技有限公司)；流动相：(A)乙腈，(B) 0.1%(体积比)磷酸溶液，流量为1.0 mL/min，梯度洗脱，洗脱程序见表2；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样体积：10 μL。

表2 梯度洗脱程序

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制

9 种目标物单一对照品储备液：分别精密称取5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，质量浓度 分 别 为290、889.02、6 876.1、298.9、304.29、761.932、817.656、471.128 4、609.5 mg/L。

9 种目标物混合对照品溶液：分别精密吸取上述单一对照品储备液适量，用甲醇溶液稀释成5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯质量浓度分别为87、44.451 0、260.283 0、149.45、304.29、380.966、327.062、94.226、304.750 mg/L的混合对照品溶液。

1.3.2 样品处理

采用一次性注射器直接吸取益肾保健酒样品适量，经0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.3.3 定量方法

根据5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯对照品的色谱保留时间，对益肾保健酒样品中的5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯成分进行定性分析，利用标准曲线外标法定量。

1.3.4 数据分析

利用仪器上自带的Chromeleon7软件用于处理色谱图、绘制标准曲线，利用Excel软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围内对样品溶液进行扫描，结果发现，5-羟甲基糠醛在285 nm 处响应最强，阿魏酸在322 nm 处有较强吸收，肉桂醛在280 nm处有较强吸收，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I在270 nm处响应最强，藁本内酯最大吸收波长为281 nm。综合各组分紫外吸收情况，确定采用检测波长280 nm同时测定5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯，在此波长下基线较稳定，未见明显漂移。

2.1.2 色谱柱

分别考察了Waters T3-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo Syncronis-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sepax HP-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)对9种目标物的分离效果。结果表明，当使用Waters T3-C18柱时，肉桂醛与朝藿定A 色谱峰不能有效分离，其余两种色谱柱均能有效分离以上9 种有效成分，相同条件下Sepax HP-C18柱色谱峰形最好，且未见其它杂质的干扰，因此选择Sepax HP-C18柱。

2.1.3 流动相选择

分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液三种流动相体系，结果表明，以乙腈-水作为流动相时，阿魏酸成分未出峰。乙腈的传质阻力小于甲醇，乙腈和甲醇分别用同样的比率与水混合时，乙腈的洗脱能力更强，当使用甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相时，宝藿苷I 与藁本内酯峰未能洗脱，因此选用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。

2.2 色谱分离效果

分别精密吸取9种目标物混合对照品溶液及样品溶液，按照1.2色谱条件进样检测，色谱图见图1。由图1可知，9种目标物混合对照品及样品在相同时间均有色谱峰出现，且各色谱峰之间分离度大于1.5，分离效果良好，表明益肾保健酒中含有5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯这9种有效成分。

图1 混合对照品溶液及益肾保健酒样品溶液色谱图

2.3 线性方程与检出限

将9 种目标物混合对照品溶液稀释成5 个不同浓度水平的混合对照品工作溶液，按照1.2色谱条件进样测定，以各目标物的质量浓度为横坐标(x)，对应的色谱峰面积为纵坐标(y)，建立标准曲线，计算线性方程和相关系数。

将9 种目标物对照品溶液进行适当稀释，制得一系列不同浓度的溶液，分别进样测定，以信噪比3对应的质量浓度作为方法检出限，信噪比10对应的质量浓度作为定量限。9 种目标物线性范围、线性方程、方法检出限和定量限结果见表3。结果表明，9 种目标物在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。

表3 9种目标物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.4 精密度试验

取同一批次益肾保健酒样品，按照1.3.2方法处理样品6 份，按1.2 色谱条件进样检测，记录色谱峰面积，测定数据见表4。由表4可知，9种目标物色谱峰面积的相对标准偏差分别为0.34%、0.39%、0.51%、0.29%、0.33%、0.57%、0.80%、1.13%、1.00%，均小于2%，表明该方法精密度良好。

表4 益肾保健酒中9种目标成分的精密度试验结果

2.5 稳定性试验

取同一益肾保健酒样品溶液，分别放置0、15、30、46、76、104 h，按1.2 色谱条件进样检测，记录色谱峰面积，测定结果见表5。由表5可知，9种目标物色谱峰面积的相对标准偏差分别为0.59%、1.19%、0.33%、1.49%、0.66%、0.62%、0.78%、0.79%、0.12%，表明益肾保健酒样品溶液中各成分在室温条件下放置104 h稳定性良好。

表5 益肾保健酒中9种目标物的稳定性试验结果

2.6 加标回收试验

精密量取已知含量的同一益肾保健酒5 mL 至10 mL 容量瓶中，分别按照样品中各成分含量的不同水平加入对应对照品适量，用35%乙醇定容。按1.2 色谱条件进行测定，计算各成分加标回收率，结果见表6。由表6可知，9种目标物的平均加标回收率 分 别 为 97.00%、99.98%、95.87%、97.74%、101.73%、98.46%、101.50%、99.53%、96.12%。表明该方法准确度较高。

表6 益肾保健酒中9种目标物的加标回收试验结果

3 结语

采用高效液相色谱测定益肾保健酒中5-羟甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I、藁本内酯的含量，该方法操作简便，重复性好，准确度高，可为益肾保健酒生产过程中的质量监控及品质评价提供参考依据。