高效液相色谱法同时测定化妆品中10种美白成分

刘莹，陈刚，丁波，刘慧香，胡文岳，高樱，李启艳

（1.山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室，特色植物资源化妆品济南市工程研究中心，济南 250101；2.烟台市食品药品检验检测中心，烟台 264035）

祛斑美白类化妆品深受消费者青睐，祛斑美白化妆品主要用于减轻皮肤表皮色素沉着，产品中往往含有能抑制黑色素的形成或加速其代谢等作用的功效成分如烟酰胺、熊果苷等[1‒2]。烟酰胺和熊果苷是国内外美白类化妆品常用原料。近几年来我国审批的特殊用途美白祛斑类产品中，发现光果甘草根提取物是添加频率最高的美白功效植物提取物[3]。光甘草定是光果甘草提取物中的主要活性成分，被誉为“美白黄金”，具有强抗氧化活性，作为美白剂，用于美白祛斑类化妆品中时，其质量分数一般为0.001%～0.1%[4]。市场上宣称具有美白功效的产品质量良莠不齐，甚至有些企业虚假宣传误导和欺骗消费者[5‒6]。2021年1月1日《化妆品监督管理条例》正式实施，我国按照风险程度，将祛斑美白类化妆品列入特殊化妆品，对其实行注册管理。2022年8月1日，中国食品药品检定研究所发布《祛斑类特殊化妆品技术指导原则(征求意见稿)》，明确企业生产此类产品的具体技术要求，应兼顾美白剂的安全性和有效性，制定出合理的添加剂量。目前，《化妆品安全技术规范》(2015 年版)已对防晒剂、染发剂、防腐剂等实行准用清单管理，但对美白剂还未建立清单管理制度，化妆品行业亟待建立美白剂准用清单，规范美白剂的安全使用范围，降低美白剂的风险，因此有必要有对化妆品中美白成分的使用情况和检测方法进行研究。

目前，关于化妆品中美白成分的检测方法有高效液相色谱法[7‒12]、气相色谱法[13‒14]、高效液相色谱-质谱法[15‒16]等，其中，高效液相色谱法应用最为广泛，而且也是化妆品检测最为常用的技术手段。《化妆品安全技术规范》(2015 年版)仅规定化妆品中禁用原料氢醌、苯酚的检测方法；国家标准GB/T 35954—2018《化妆品中10 种美白祛斑剂的测定高效液相色谱法》和文献[4‒9]虽然都建立了同时测定多种美白功效成分的液相色谱检测方法，但是不同品牌的产品添加美白功效成分的含量差别较大，同时市场上使用的美白成分种类繁多，甚至有些产品不惜使用禁用组分如汞及其化合物、氢醌和苯酚等从而达到理想的祛斑美白效果，现有的检测方法不能完全满足监管需求，难以保证此类产品的安全性与有效性。

笔者选取市售化妆品使用频率高的美白成分以及禁用组分氢醌和苯酚为研究对象，建立了液相色谱法同时测定化妆品中光甘草定等10 种美白功效成分(包括2种禁用成分)的检测方法，一方面了解产品是否如实添加了所宣称的美白功效成分以及添加的水平情况，另一方面筛查是否有违规使用禁用原料的行为，从而为化妆品监管部门打击企业对于化妆品功效成分的虚假添加以及违规添加禁用原料的行为提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要的仪器与试剂

电子分析天平：MS105DU 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

高效液相色谱仪：Agilent1260 型，配二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司。

超纯水机：Milli-Q型，美国密理博公司。

离心机：Universal 320R型，德国Hettich公司；

数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。

甲醇：色谱纯，德国默克公司。

磷酸：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

烟酰胺、熊果苷、氢醌、阿魏酸、苯酚：质量分数分别为99.9%、99.7%、99.8%、99.0%、100.0%，中国食品药品检定研究院。

3-O-乙基-L-抗坏血酸、苯乙基间苯二酚：质量分数均为98%，日本TCI公司。

丁基间苯二酚：质量分数为97%，美国Ark Pharm公司。

己基间苯二酚：质量分数为98%，北京J&K公司。

光甘草定：质量分数为98%，上海源叶生物科技有限公司。

化妆品样品：均来自市售美白祛斑类产品。实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：烟酰胺和熊果苷230 nm，3-O-乙基-L-抗坏血酸250 nm，其余280 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；流动相A：0.02%(体积分数)磷酸溶液，流动相B：甲醇，流量为1.0 mL/min。梯度洗脱程序(体积分数)：0～3 min，95%A；3～13 min，95%A→30%A；13～21 min，30%A→5%A；21～26 min，5%A；26～26.1 min，5%A→95%A；26.1～35 min，95%A。

1.3 标准溶液配制

烟酰胺、3-O-乙基-L-抗坏血酸标准储备溶液：质量浓度均为1 mg/mL，分别准确称取烟酰胺、3-O-乙基-L-抗坏血酸各50 mg，分别置于50 mL 容量瓶中，用水溶解并定容。

熊果苷标准储备溶液：2 mg/mL，准确称取别熊果苷100 mg，置于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

氢醌、苯酚、阿魏酸、丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚、己基间苯二酚、光甘草定标准储备溶液：质量浓度均为1 mg/mL，分别准确称取氢醌、苯酚、阿魏酸、丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚、己基间苯二酚、光甘草定各50 mg，分别置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

混合标准溶液：分别吸取以上标准储备溶液适量，用甲醇稀释定容，于4 ℃冰箱保存。

系列混合标准溶液：精确吸取混合标准溶液，用甲醇稀释成系列混合标准溶液。各成分的质量浓度见表1。

表1 系列混合标准溶液中各组分的质量浓度 μg/mL

1.4 实验步骤

1.4.1 样品溶液制备

准确称取化妆品样品0.2 g(精确到0.001 g)于10 mL 具塞试管中，用80%(体积分数，下同)甲醇定容至标线，超声提取20 min，使样品完全分散，于3 500 r/min 离心10 min，经0.45 μm 滤膜过滤后备用。

1.4.2 测定方法

取系列混合标准溶液及样品溶液，按1.2 色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，以混合标准溶液质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标建立标准工作曲线，计算线性方程，利用标准曲线法计算样品中待测成分的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

分别采集各组分的紫外吸收光谱图，发现烟酰胺和熊果苷的吸收峰在230 nm附近；3-O-乙基-L-抗坏血酸吸收峰在250 nm 附近；氢醌、苯酚、阿魏酸、丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚、光甘草定和己基间苯二酚的吸收峰在280 nm附近，因此分别选择230、250、280 nm作为对应组分的检测波长。

2.1.2 流动相的选择

在文献8和11基础上比较了水-甲醇、磷酸二氢钾-甲醇、磷酸溶液-甲醇为流动相时的分离效果。结果表明，在水-甲醇和磷酸二氢钾-甲醇两种体系下阿魏酸和苯酚分离效果不理想，最终选择磷酸溶液-甲醇作为流动相。10 种成分混合标准溶液、空白基质、加标样品的色谱图如图1～图3所示。

图1 10种成分的混合标准溶液色谱图

图2 空白基质色谱图

图3 基质加标色谱图

2.2 提取溶剂的选择

分别考察了甲醇、80%甲醇溶液和50%甲醇溶液作为提取溶剂时各组分的回收率。结果表明，采用50%甲醇溶液作为提取溶剂时，光甘草定和己基间苯二酚回收率较低，均未达到50%，采用甲醇溶液和80%甲醇溶液作为提取溶剂时，各成分的回收率均在85%～115%之间，符合相关要求，最终从节约环保角度考虑，选择80%甲醇溶液为提取溶剂。

2.3 线性范围、相关系数、检出限和定量限

利用所建实验方法对系列混合标准溶液进行测定，以各组分的质量浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标，计算其线性回归方程及相关系数，结果显示，10 种目标物在各自线性范围内，各待测物的质量浓度与对应色谱峰面积线性关系良好。10 种目标物的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限(信噪比为3)、定量限(信噪比为10)见表2。

表2 10种目标物线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 准确度与精密度

准确称取面霜、乳液、水剂、粉底液、凝胶五种类型空白样品，进行低、中、高三个浓度水平加标，每个加标水平平行制备6份，然后按1.4.1 方法制备样品溶液，分别测定并计算各目标物回收率和相对标准偏差，结果列于表3。结果表明，10种目标物的回收率为93.43%～112.7%，相对标准偏差为0.05%～3.11%，满足《化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范》的相关要求。

表3 样品加标回收试验结果(n=6)

3 结语

建立了高效液相色谱法测定化妆品中10 种美白成分的检测方法，并对其进行了方法学验证。该方法样品处理简单、准确度高，能较好地评估化妆品的安全性与有效性，为化妆品的质量监督管理和消费者的健康权益提供技术保障。