超高效液相色谱-串联质谱法测定牛羊肉中瘦肉精

孙丽，邢海艳，吴义春，赵燕，周义国，孟庆顺

（淮安市食品药品检验所，江苏淮安 223000）

瘦肉精是一类药物的统称，能够抑制动物脂肪生成，促进瘦肉生长的物质都可以称为瘦肉精。能够实现此类功能的物质主要是一类叫做β-受体激动剂(也称β-兴奋剂)的药物，其中较常见的有盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等。β-受体激动剂类药物进入牲畜体内后能够改变养分的代谢途径，促进动物肌肉生长，尤其是促进骨路肌蛋白瘦肉质的合成，加速脂肪的转化和分解，提高牲畜的瘦肉率[1]。但由于瘦肉精在动物体内吸收快，代谢慢，人食用瘦肉精残留量较高的动物产品后，会出现严重的不良反应，如呼吸困难、心跳加速、头晕头疼等症状，严重时能引起心脏病、高血压等疾病[2‒4]。目前我国瘦肉精监管的对象主要是饲料和猪肉，牛羊肉由于其检测技术的相对缺乏，存在较高的瘦肉精检出风险[5‒6]。随着我国居民肉类消费结构逐渐升级，以及受非洲猪瘟的影响，牛羊肉消费需求不断增加，因此为了确保牛羊肉的食品质量与安全，亟需开展测定其瘦肉精的方法研究。

当前瘦肉精的测定方法主要有胶体金试纸条法[7‒8]、酶联免疫法[9]、气相色谱-质谱联用法[10‒11]和液相色谱-质谱联用法[12‒14]等。胶体金试纸条法和酶联免疫法是基于抗原-抗体特异性结合的快筛方法，此方法具有操作简便、快捷、特异性强等特点，但存在难以一次分析多个化合物且会出现一定假阳性的缺点。气相色谱-质谱联用法需要复杂的衍生化步骤以增强目标物的挥发性，且分析物不稳定、分析耗时较长。液相色谱-质谱联用法以其高灵敏度和专一性测定目标物，近几年来在瘦肉精检测方法研究中应用越来越多。笔者建立了一种准确、高效、简单的测定牛羊肉中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种瘦肉精含量的方法，为食品安全监测提供了技术手段。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：AB QQQ4000+型，美国AB SCIEX公司。

电子天平：XS205DU 型，感量为0.01 mg，梅特勒托利多科技(中国)有限公司。

高速冷冻离心机：MULTIFUGE-X1R 型，美国赛默飞世尔科技公司。

超声波清洗器：KH7200DE型，昆山禾创超声仪器有限公司。

超纯水机：GenPure Pro 型，美国赛默飞世尔科技公司。

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇混合标准溶液：各组分质量浓度均100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司。

克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3 内标溶液：质量浓度均为100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司。

甲酸：色谱纯，上海易恩化学技术有限公司。

乙酸铵：色谱级，上海麦克林生化科技股份有限公司。

兽药残留专用提取包：日本岛津公司。

兽药残留专用净化管：日本岛津公司。

牛羊肉样品：市售。

实验用气：自制高纯氮气，纯度大于99.9%。

1.2 溶液配制

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准储备液：各组分质量浓度均为10 μg/mL，准确移取克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准溶液1.0 mL至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线。

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准中间液：各组分质量浓度均为1 μg/mL，准确移取克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准储备液1.0 mL至10 mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容至标线。

混合内标储备液：克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3质量浓度均为10 μg/mL，准确移取克伦特罗-D9 内标溶液1.0 mL、沙丁胺醇-D3 内标溶液1.0 mL 至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线。

混合内标中间液：克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3质量浓度均为1 μg/mL，准确移取混合内标储备液1 mL 至10 mL 容量瓶中，以甲醇稀释并定容至标线。

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺系列混合标准工作溶液：分别移取克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准中间液0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.04 mL，加入混合内标中间液100 μL 至10 mL 容量瓶中，以空白基质溶液(阴性样品溶液)定容至标线，得3 种组分质量浓度均分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ng/mL 的系列混合标准工作溶液，其中内标物质量浓度均为10 ng/mL。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 液相色谱仪

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®BEH C18柱[100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流动相：A相为0.1%(体积分数，下同)甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸铵)，B 相为甲醇；流动相流量：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：2 μL；淋洗方式：梯度淋洗，淋洗程序见表1。

表1 流动相梯度淋洗程序

1.3.2 质谱仪

离子源：电喷雾电离源(ESI)；检测方式：多反应监测(MRM)；碰撞气压力：48.3 kPa；气帘气压力：241.3 kPa；雾化气压力：413.7 kPa；辅助加热气压力：379.2 kPa；雾化电压：5 500 V；离子传输温度：550 ℃；克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺及内标物克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3的质谱参数见表2。

表2 克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺及内标物质谱参数

1.4 样品预处理

称取5 g 均匀样品，置于50 mL 离心管中，加入50 μL 混合内标中间液，然后加入5 mL 5%(体积分数)甲酸乙腈溶液，均质1 min，加入兽药残留专用提取包，快速振摇涡旋提取2 min，以10 000 r/min转速离心5 min。取离心后的样品上清液加入到净化管中，涡旋2 min，以13 000 r/min 转速离心5 min。取上清液作为样品溶液。

1.5 实验步骤

在1.3仪器工作条件下，对克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺系列混合标准工作溶液和样品溶液进行测定，同时做空白试验。以克伦特罗、沙丁胺醇特征离子色谱峰的峰面积与对应内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标，相应的克伦特罗、沙丁胺醇质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，采用内标法定量；以莱克多巴胺特征离子色谱峰的峰面积为纵坐标，相应的莱克多巴胺质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，采用外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别取克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准中间液、混合内标中间液进行质谱分析，确定最佳的定量离子对、定性离子对、去簇电压和碰撞电压，优化结果见1.3.2。

2.2 液相条件的优化

分别以纯水、0.1%甲酸溶液、5 mmol 乙酸铵溶液、0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸铵)为水相，以甲醇和乙腈为有机相，考察了不同流动相组合时目标物的色谱图，各目标物色谱峰特点见表3。

表3 不同流动相的出峰情况

结果表明，水相流动相选择0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸铵)，有机相选择甲醇时，3 种瘦肉精的峰形对称，无拖尾，响应值高，线性关系好，流动相中添加甲酸可提高目标化合物的离子化效率，添加乙酸铵可调节流动相pH，使目标化合物色谱峰形对称。因此选择0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸铵)与甲醇作为流动相，色谱图见图1和图2。

图1 克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准溶液的总离子色谱图

图2 混合内标溶液的总离子色谱图

2.3 色谱柱的选择

由于克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺均属于极性化合物，常用C18色谱柱进行色谱分离。分别使用Waters ACQUITY UPLC®BEH C18柱[100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，沃 特 世 科 技(上 海)有 限 公 司]、Phenomenex KINEVEXR C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司)、Thermo AcclaimTMTrinityTMB1 C18柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，美国赛默飞世尔科技公司)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱[100 mm ×3 mm，2.7 μm，安捷伦科技(中国)有限公司]4 种型号色谱柱对3 种瘦肉精的分离效果进行考察，结果发现，Waters ACQUITY UPLC®BEH C18柱分离效果最好，峰形对称，无拖尾，因此选择Waters ACQUITY UPLC®BEH C18柱。

2.4 线性范围和定量限

按1.5 实验步骤分别测定克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺系列混合标准工作溶液并绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。以空白样品（加标准溶液）的3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表4。结果表明，3 种瘦肉精质量浓度在0.1～4.0 ng/mL 范围内呈线性关系，线性相关系数均大于0.998，检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg。

表4 3种瘦肉精的线性方程、相关系数和检出限

2.5 样品加标回收试验

向牛羊肉阴性样品中添加克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺混合标准中间液，使样品中3 种目标物质量分数均分别为0.2、0.4、2.0 μg/kg，每个点平行制备6 份，同时做空白试验，按照1.5 实验步骤处理样品，测定样品中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，结果见表5。

表5 加标回收试验结果

由表5 可知，3 种瘦肉精平均回收率为65.3%～105.8%，相对标准偏差(RSD)为0.95%～9.65%(n=6)，空白试验中未检出克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，表明该方法具有良好的准确度和精密度。

2.6 方法比对

对从市场抽检的103 批牛羊肉样品检测，代表性的羊排样品色谱图如图3，在这些样品检测过程中未发现有干扰目标物测定的杂质峰。103批牛羊肉的检测结果见表6，其中3批羊肉、1批羊排和1批牛肉检出克伦特罗，与按标准方法[15]处理相比，结果误差均在10%之内，满足检测需求。

图3 羊排样品总离子色谱图

表6 牛羊肉中瘦肉精含量检测结果比较 μg/kg

3 结语

对牛羊肉中3 种瘦肉精进行提取净化，采用超高效液相色谱-串联质谱法对牛羊肉样品中瘦肉精残留量进行同时测定。该方法实验步骤简单，分离效果好，灵敏度高，具有良好的准确度和精密度，可以更加简便、快捷、准确的测定牛羊肉样品中的瘦肉精，为食品监管和检测提供新的方法。