以芦苇为碳源进行灵芝液体菌种发酵条件的优化

刘静雯，辛世纪，王竟夷，连洁，黄亮，班立桐

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392）

灵芝（Ganoderma lucidum），属于多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（GanodermaKarst.），为一种珍贵的药用真菌[1-2]。灵芝液体发酵不仅可以获得灵芝的主要活性成分，且发酵后的菌丝体也具有很高的应用价值，经干燥处理后的菌丝体可作为辅料加工制成各种保健食品[3]。液体发酵技术具有周期短、易操作、成本低等优点，通过液体发酵技术获得灵芝菌体更加便利、成本更低，对于灵芝工厂化生产更便捷[4-5]。

天津市湿地总面积为248 784.8 hm2，占天津市域总面积的20. 9%[6]，其中芦苇湿地为湿地的重要组成部分。芦苇具有生长速度快[7]，耐盐性高[8]的特点，在维持湿地生态系统平衡和物种多样性方面起着重要作用[9]。近年来随着人类不合理地利用，以芦苇为造纸原材料的产业逐渐转型，芦苇失去了其主体利用价值，引发了资源浪费和水体富营养化[10]等问题。因此，如何科学、合理利用芦苇资源，缓解生态建设与经济效益的矛盾是当前亟需要解决的问题。

芦苇秸秆中富含纤维素、半纤维素、木质素[11]，可作为灵芝生长所需碳源。将芦苇秸秆应用到灵芝液体培养中，优化灵芝液体培养基及培养条件，根据菌丝体产量优化其发酵工艺，既解决了芦苇资源浪费、污染环境的问题，又为灵芝液体培养提供了新的原料，为芦苇-灵芝液体发酵技术的开发提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

泰山灵芝G8，保藏于天津农学院食用菌研发中心。

1.1.2 秸秆来源及处理

芦苇秸秆来源：天津市蓟州区于桥水库前置库。

水稻秸秆来源：辽宁省辽阳市灯塔市。

玉米、小麦秸秆来源：天津市宁河区优质农产品开发示范中心基地。

秸秆预处理：105 ℃杀青2 h，后80 ℃烘干至恒重，自然冷却至室温后，粉碎过60目筛备用。

1.1.3 培养基

PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 g，琼脂20 g。

基础发酵培养基：葡萄糖3%，蛋白胨1%，KH2PO40.15%，MgSO40.075%，pH 自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝干重测定

取样经滤纸过滤，将过滤所得菌丝置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，计算菌丝干重。

1.2.2 菌丝生长曲线的测定

接种后静置1 d 后放至25 ℃，150 r/min 摇床培养。于第4 天开始取样，计算菌丝干重。以培养时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制菌丝生长曲线，并根据生长曲线确定取样时间。

1.2.3 单因素筛选

（1）秸秆种类：分别添加芦苇、水稻、玉米、小麦秸秆，添加量为0.5%，7 d 后测定菌丝干重。

（2）芦苇秸秆添加量：分别添加0%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%芦苇秸秆，测定菌丝干重，以确定最佳芦苇秸秆添加量。

（3）pH：设置不同pH 梯度，分别为3、4、5、6、7，测定菌丝干重，确定最佳pH。

（4）氮源筛选：分别添加10 g/L 的蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵、酵母浸粉进行灵芝液体培养，7 d 后测定菌丝干重。

（5）氮源添加量：确定酵母浸粉为最佳氮源，分别添加不同氮源添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，7 d 后测定菌丝干重。

（6）温度：分别设置不同温度为23、25、27、29、31 ℃，7 d 后测定菌丝干重。

（7）转速：分别设置不同转速为110、130、150、170、190 r/min，7 d 后测定菌丝干重。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素筛选试验确定以酵母浸粉为氮源，以芦苇秸秆添加量、氮源添加量、pH 值为研究因素，设计L9（33）的正交试验，正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计表

2 结果与分析

2.1 灵芝菌丝生长曲线

灵芝菌丝随时间生长情况如图1 所示。由图1可见，0～6 d 为生长迟缓期，6～7 d 为快速生长期，菌丝生长迅速，7 d 后进入稳定期。根据菌丝生长曲线确定最佳取样时间为第7 天。

图1 灵芝生长曲线

2.2 单因素筛选试验

2.2.1 添加不同秸秆对灵芝生长的影响

由图2 可知，添加不同种类的秸秆作为培养基碳源对灵芝生长产生不同影响，其中添加芦苇秸秆的培养基中灵芝菌丝干重大于其他处理，菌丝干重大小顺序依次为：芦苇秸秆（4.33 g/L）＞水稻秸秆（3.82 g/L）＞对照组（3.73 g/L）＞小麦秸秆（3.3 g/L）＞玉米秸秆（2.1 g/L）。因此，选择芦苇秸秆作为培养基碳源。

图2 不同秸秆碳源对菌丝干重的影响

2.2.2 芦苇秸秆添加量对泰山灵芝液体培养菌丝生长的影响

碳源作为灵芝生长最主要的营养部分，对其生长进程起着十分关键的作用。由图3 可见，随着芦苇秸秆添加量的增加，菌丝干重呈先升高后降低的趋势，在芦苇秸秆添加量为0.3%～1.0%时，菌丝产量较高，当芦苇秸秆添加量为0.5%时，菌球数量较多且大小均匀，菌丝干重达到最大值，为10.92 g/L。故选择芦苇秸秆添加量为正交试验的因素。

图3 芦苇秸秆添加量对菌丝干重的影响

2.2.3 pH 对泰山灵芝液体培养菌丝生长的影响

由图4 所示，在pH＝5 时，泰山灵芝菌丝产量高于其他pH 条件下的菌丝干重，菌丝产量达到最高，为11.47 g/L，故选择pH 为正交试验的因素之一。

图4 pH 对菌丝干重的影响

2.2.4 氮源对泰山灵芝液体培养菌丝生长的影响

由图5 可知，灵芝液体发酵时对各种氮源的利用情况不同，其中尿素、硝酸铵利用效率较低，而灵芝菌丝对于迟效的有机氮源如蛋白胨与酵母浸粉的利用效率更高，其中，以酵母浸粉为氮源的组别菌丝干重最高，达11.57 g/L。因此，酵母浸粉更加有利于灵芝菌丝的生长。

图5 不同氮源种类条件下菌丝干重

2.2.5 氮源添加量对泰山灵芝液体培养菌丝生长的影响

由图6 可知，当酵母浸粉添加量为1%时对灵芝菌丝体生长最有利，菌丝干重最高为11.58 g/L。菌丝在不同氮源条件下的生长速率以及在生长过程中产生的代谢产物含量不同。因此，筛选合适的氮源对于提高灵芝菌丝产量十分重要，故选择氮源添加量作为正交试验的研究因素。

图6 酵母浸粉添加量对菌丝干重的影响

2.2.6 转速对泰山灵芝液体培养菌丝生长的影响

转速的改变可以导致溶氧与剪切力的变化，溶氧对菌体生长和积累代谢产物都有较大影响，溶氧过低过高都会对菌体生长造成不良影响[12]，而搅拌剪切力对菌丝体生长的影响也十分显著[13]。由图7 可知，当转速为150 r/min 时，最适宜菌丝生长，此时菌丝干重达10.48 g/L。

图7 转速对菌丝干重的影响

2.2.7 温度对泰山灵芝液体培养菌丝生长的影响

温度会影响微生物的新陈代谢，对机体酶促反应有极大影响，因此，温度对灵芝菌丝体生长和代谢物的积累至关重要[14]。由图8 可知，当温度为25 ℃时，菌丝干重最高达11.23 g/L，这与汪金萍等[15]所得28 ℃为最优培养温度的结果不同。

图8 温度对菌丝干重的影响

2.3 正交试验结果分析

正交试验结果分析如表2 所示。R值的大小反映了该因子对试验结果的影响程度。影响试验结果的各因素顺序为：芦苇秸秆添加量＞pH＞氮源添加量。最佳培养基配方为A2B3C3，即芦苇秸秆添加量0.5%，酵母浸粉添加量1.5%，pH 为6。

表2 正交试验结果分析

正交试验方差分析结果见表3，表明芦苇秸秆添加量对灵芝液体培养产菌丝有显著性差异，氮源添加量、pH 对灵芝液体培养产菌丝具有极显著性差异。

表3 正交试验方差分析表

2.4 验证试验

对筛选出的组合进行验证，验证结果如图9所示。经测定，在组合为A2B3C3的条件下培养，菌丝干重为12.20 g/L，该结果与基础培养基结果相比有所提高，且菌球小而紧实，分散均匀。

图9 验证试验

利用液体菌种进行栽培试验，由于优化后的灵芝液体菌种菌丝产量高、菌球小、分散均匀、萌发点多，较优化前可减少灵芝子实体栽培所需接种量。优化后所需接种量与正常所需接种量出芝情况相同，经检测，栽培料子实体平均产量为54.58 g/kg，收获的灵芝子实体见图10。可见本试验筛选的配方可以实现灵芝的正常出芝，具有良好的推广价值。

图10 灵芝子实体

3 讨论与结论

灵芝生长代谢过程中的主要物质包含碳源，碳源是构成细胞物质的基本元素，为菌丝体生长发育提供了基本能量[16]，灵芝菌丝体生长过程中对于不同的碳源的利用效率不同[17]。芦苇秸秆作为一种复合有机物质，不仅为灵芝菌丝体提供生长所需的碳源，也为灵芝液体发酵提供其他所需的营养物质。低剪切力影响发酵液混合以及氧传递，导致溶氧量降低[18]，从而使菌丝产量降低，加入芦苇秸秆后摇瓶中的剪切力大大增加，与基础培养基相比菌丝产量显著提高了135%。真菌生长过程中离不开氮源，与无机氮源相比，灵芝对有机氮源的利用效率更高，因此氮源的选择与添加量也是影响灵芝菌丝生长的重要因素。选择酵母浸粉作为灵芝液体发酵的氮源，并通过调节酵母浸粉添加量来筛选最适宜灵芝液体发酵的培养基氮源，这与冯杰等[19]所研究的以酵母自溶粉作为发酵的氮源最优结果相同。pH 会对灵芝细胞膜的通透性造成影响，在代谢调控中也发挥着十分关键的作用，因此，pH 会导致灵芝液体发酵中生物量的不同[20-21]。此次通过正交试验筛选出最适宜灵芝液体发酵的pH 为6，这与凌庆枝等[22]与潘江安等[23]研究发现菌丝体生长的最适pH 为偏酸性结果相近。

本研究首次添加芦苇秸秆进行灵芝液体菌种发酵培养，条件优化后的灵芝菌丝体产量可达12.20 g/L，是优化前的1.51 倍，具有良好的菌丝球形成效果，有助于栽培后的出芝，孢子粉产量也较高。研究结果为芦苇秸秆资源利用及灵芝液体发酵工业化生产提供了理论依据和试验指导。