低温锻炼提高水稻秧苗耐低温能力的生理和分子机制研究

徐青山 魏倩倩，2 孔亚丽 潘 林，3 朱练峰田文昊 张均华，* 朱春权，*

（1中国水稻研究所，水稻生物育种全国重点实验室，浙江 杭州 310006；2安徽大学资源与环境工程学院，安徽 合肥 230039；3牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157000）

水稻（Oryza sativaL.）是我国重要的粮食作物之一。据国家统计局数据显示，2020 年全国早稻种植面积为0.71 亿亩，双季稻种植面积为1.43 亿亩，两者种植面积占水稻种植总面积的47.22%［1］。而随着全球气候变暖，生产上大幅提前水稻播种时间，使单季早稻和双季早稻育秧期间更易遭受极端低温天气的侵扰。因此，提高水稻秧苗的耐低温能力对确保我国早稻和双季稻的安全生产有重要意义。

逆境锻炼是指植株经过前期适度的逆境处理后，产生可逆的染色质表观修饰变化，使植物在再次面对严重的相同或不同逆境胁迫时产生较强抗性的现象［2］。根据再次发生的非生物胁迫的类型及时间，可将非生物逆境锻炼类型分为四类：当代同种逆境锻炼效应、当代交叉逆境锻炼效应、跨代同种逆境锻炼效应和跨代交叉逆境锻炼效应［3-4］。与未经过锻炼植株相比，经过锻炼植株的信号调控物质、次级代谢产物、胁迫保护性物质等可以更快、更有效地对再次发生的逆境胁迫产生响应，从而增强植株耐逆性［5-6］。例如，用水稻生长临界温度进行低温锻炼能通过提高水稻总酚含量、抗氧化酶活性和水稻耐冷基因的表达量来提高水稻抗低温能力［7］；低温锻炼可减轻后期低温胁迫对荷花地下茎膜系统的伤害、增加细胞内渗透调节物质的含量、提高抗氧化酶活性，从而提高荷花的抗寒性［8］。

水稻育秧是水稻生产过程中的重要一环，提高水稻育秧的抗寒性对于早稻幼苗的发育至关重要。有关低温锻炼提高植物耐低温能力的研究已有报道，但对于低温锻炼提高水稻秧苗耐低温能力的生理与分子机制研究仍较少。因此，本研究通过基质育秧对两叶一心期的秧苗进行低温锻炼处理，常温恢复2 d 后，再次对秧苗进行低温胁迫处理，并测定水稻秧苗的生化指标和基因表达，旨在阐明前期低温锻炼提高水稻秧苗耐低温能力的生理与分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以中国水稻研究所提供的传统籼型早稻中早39作为试验水稻品种，并用其研发的无土基质（广西常乐科技股份有限公司）作为育秧基质，其中基质pH 值为6.39±0.02，电导率为（3.57±0.04） mS·cm-1，容重为（0.29±0.01） g·cm-3，全氮含量为（4.99±0.50） g·kg-1，全磷含量为（2.65±0.37） g·kg-1，全钾含量为（11.47±0.79） g·kg-1，碱解氮含量为（1 100.63±27.20） mg·kg-1，有机磷含量为（87.60±3.84） mg·kg-1，速效钾含量为（1 899.73±23.10） mg·kg-1。

1.2 试验设计

用2.6%的次氯酸钠处理水稻种子30 min，随后用去离子水冲洗种子3 遍。将冲洗后的种子放在清水中浸泡48 h，然后用去离子水冲洗种子3次，将种子放置在培养箱中32 ℃催芽24 h。将催芽后的种子均匀的播在七寸秧盘中，每个秧盘播90 g种子，待种子长到两叶一心期时，将秧苗进行低温锻炼1 d，恢复2 d后再次进行为期3 d的低温胁迫处理，每个处理3个重复（表1）。处理结束后收集水稻样品用液氮研磨，置于-80 ℃冰箱进行保存，随后进行生理指标的测定。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.3 基质指标测定

基质pH值和电导率在10∶1的水土比下振荡30 min后用便携式pH/离子/溶解氧多参数测定仪（上海梅特勒-托利多有限公司）进行测定；基质样品用H2SO4-H2O2消煮后，全氮磷钾含量分别采用半微量凯氏法、钼睇抗比色法和火焰光度计法进行测定；碱解氮含量采用碱解扩散法测定；有机磷含量（NaHCO3浸提）用钼睇抗比色法测定；速效钾含量（NH4OAc 浸提）用火焰光度计法进行测定［9］。

1.4 植株指标测定

1.4.1 秧苗素质考察 每个秧盘随机选取20 株处理过后的秧苗，分别量取其根长、株高、叶龄和根数。取10 株秧苗，茎部并拢量取茎基宽，同时称取20 株秧苗的地上部干重和地下部干重［10］。

1.4.2 水势和根系活力测定 叶片水势采用WP4C

露点水势仪（美国METER公司）进行测定，根系活力采用氯化三苯基四氮唑法测定［11］。

1.4.3 叶绿素含量和光系统II 荧光量子效率测定叶绿素含量采用95%的乙醇提取，随后在470、649 和665 nm下比色，通过以下公式计算叶绿素a（chlorophyll a，Chl a）和叶绿素b（chlorophyll b，Chl b）含量［12］：

式中，A649、A665分别为叶绿素提取液在649和665 nm处的吸光值。

最大光化学效率（maximum photochemistry efficiency，Fv/Fm）和实际光化学效率（actual photochemical efficiency，ΦPSⅡ）采用PAM-2500 便携式调制叶绿素荧光仪（德国WALZ公司）测定［13］。

1.4.4 丙二醛含量及抗氧化酶活性测定 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法进行测定［9］；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性采用高锰酸钾滴定法进行测定［14］；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法测定；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑法进行测定［15］；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性采用苏州科铭生物技术有限公司的检测试剂盒测定。

1.4.5 耐冷基因相对表达量测定 将水稻幼苗叶片剪下，加入液氮充分研磨，取0.05 g置于2 mL无菌离心管中，加入1 mL TRIzol和0.2 mL氯仿，摇匀，冰置5 min，随后4 ℃下13 000 r min-1离心5 min，取上层水液置于新的无菌离心管中。随后加入0.5 mL 异丙醇，摇匀冰置10 min后，4 ℃下13 000 r min-1离心5 min，弃去上清液，再向其中加入1 mL 75%的乙醇将沉淀清洗，4 ℃下13 000 r min-1离心5 min 后，弃去乙醇，室温干燥RNA沉淀后向其中加入0.2 mL 的灭菌去离子水溶解RNA沉淀，此时溶液即为RNA 提取液。RNA 提取后，用NanoPhotometer-N50（德国Implen公司）检测总RNA的纯度和含量，用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性。然后使用PrimeScript 逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）将其逆转录成cDNA。最后，采用Sybgreen（日本TaKaRa 公司）进行实时荧光定量PCR。以OsHistone为内参基因，所选基因的引物和内参引物详见表2。

表2 本研究所用引物序列Table 2 The sequences of primers used in the present study

1.5 数据处理

试验数据采用SAS9.2软件进行统计分析（单因素方差分析），均数采用Tukey 法检验统计学差异。采用Origin2018 软件绘制图表，图、表中不同字母表示处理间均值在P<0.05水平上有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 秧苗形态

由图1 可知，与常温处理相比，直接低温胁迫的秧苗因出现生理性失水而使叶片卷曲，而经过低温锻炼后的秧苗遭受低温胁迫时，叶片未出现卷曲现象，说明低温锻炼维持了秧苗体内水分代谢平衡，避免了水稻在低温胁迫下的生理性失水现象。

图1 不同处理对水稻秧苗形态的影响Fig.1 Effect of different treatments on rice seedling morphology

2.2 秧苗素质

由表3可知，与常温处理（N+N、E+N）相比，低温处理（N+C、E+C）下秧苗的株高、根长、叶龄、茎基宽和地下部干重整体显著下降，根数和地上部干重也存在下降趋势，但差异不显著。而经过低温锻炼的水稻，在对其再次进行为期3 d 的低温胁迫后（E+C），其地下部干重较直接进行低温胁迫处理（N+C）显著提高8.36%，其余参数与直接低温胁迫处理相比并无显著差异。

表3 不同处理对水稻秧苗素质的影响Table 3 Effect of different treatments on the quality of rice seedlings

2.3 水稻叶片水势及根系活力

由图2 可知，与常温处理（N+N）相比，低温处理（N+C）下水稻叶片的水势和根系活力分别显著下降81.56%和18.22%，但经过低温锻炼的水稻，在对其再次进行低温胁迫后（E+C），其根系活力较直接低温胁迫处理（N+C）显著提升70.39%，同时，叶片的水势提高6.20%，但差异并不显著。

图2 不同处理对水稻秧苗叶片水势和根系活力的影响Fig.2 Effect of different treatments on leaf water potential and root activity of rice seedlings

2.4 叶绿素含量和光系统Ⅱ量子荧光效率

由图3 可知，与常温处理（N+N）相比，低温处理（N+C）下水稻叶片的叶绿素a、叶绿素b含量、ΦPSⅡ和Fv/Fm显著降低。而经过低温锻炼的秧苗，再次面对低温胁迫时（E+C），其叶片叶绿素a、叶绿素b 含量、ΦPSⅡ和Fv/Fm较直接低温胁迫处理（N+C）的秧苗分别显著提高15.89%、13.61%、32.11%和19.07%。

图3 不同处理对水稻秧苗叶片叶绿素含量和光系统II量子荧光效率的影响Fig.3 Effect of different treatments on chlorophyll content and photosystem II quantum fluorescence efficiency of rice seedling leaves

2.5 抗氧化酶活性及丙二醛含量

由表4 可知，与常温处理（N+N）相比，低温胁迫处理（N+C）显著提高了水稻体内CAT、SOD 活性和MDA 含量。而经过低温锻炼的秧苗，再次面对低温胁迫时（E+C），其GPX、APX、CAT 和POD 活性较直接低温胁迫处理（N+C）秧苗分别显著提高13.68%、13.28%、13.27%和17.83%，同时MDA 含量显著降低25.87%。

表4 不同处理对水稻秧苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响Table 4 Effect of different treatments on antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content of rice seedlings

2.6 耐冷基因相对表达量

由图4 可知，与常温处理（N+N）相比，低温胁迫处理（N+C）显著提高了耐冷基因OsTrx23的相对表达量，而耐冷基因OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN的相对表达量则显著降低。经过低温锻炼的秧苗，再次面对低温胁迫时（E+C），其耐冷基因OsTrx23、OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN的相对表达量较直接低温胁迫处理（N+C）整体显著提高1.17、0.15、0.58和1.26倍。

图4 不同处理对水稻秧苗耐冷基因相对表达量的影响Fig.4 Effect of different treatments on the relative expression of cold tolerance genes in rice seedlings

3 讨论

3.1 低温锻炼对低温胁迫下水稻秧苗吸收水肥能力的影响

在低温寡照下，植株的根系活力会显著降低，根系的代谢过程也会遭到破坏；发育不良的根系不仅不利于养分和水分吸收，更会阻碍养分和水分向地上部运输［16］。在本试验中，低温胁迫会使水稻秧苗出现生理性失水，导致植株水势显著降低，而经过低温锻炼的秧苗再次遭受低温胁迫时，其叶片形态并不会发生失水卷曲，而是仍然保持伸展状态（图1）。同时，低温胁迫还会使秧苗根系发育不良，根系活力严重下降，而经过低温锻炼的秧苗再次遭受低温胁迫时，其根系活力会显著增加（图2）。由此推测低温锻炼可能通过提高水稻秧苗的根系活力来提高根系的吸水能力，使低温胁迫下的秧苗维持正常的水分代谢平衡，促使低温胁迫下的水稻秧苗叶片仍维持较高的水势。

3.2 低温锻炼对低温胁迫下水稻秧苗叶绿素含量和光系统II量子荧光效率的影响

与常温下生长的植株相比，低温胁迫会通过改变植株的叶片形态，降低植株叶片的相对生长率、叶面积比率和叶绿素含量来抑制植物的光合作用，最终降低植株生物量［17］。同时，低温胁迫对水稻早期营养生长的主要生理效应是由光系统II的电子传递抑制引起的光抑制，而Fv/Fm是检测光抑制的典型指标［18］。在本试验中，通过对不同处理下水稻叶片Chl a、Chl b 含量、Fv/Fm和ΦPSⅡ的测定发现，与常温处理的秧苗相比，直接进行低温胁迫处理的水稻秧苗Chl a、Chl b 含量、Fv/Fm和ΦPSⅡ均显著降低，而经过低温锻炼的秧苗再次遭受低温胁迫时，其Chl a、Chl b含量、Fv/Fm和ΦPSⅡ依然维持较高水平（图3）。这表明前期低温锻炼处理可以通过提高水稻秧苗叶片叶绿素含量、最大光化学效率和实际光化学效率来促进低温胁迫处理下水稻秧苗的光合作用，同时缓解低温胁迫给水稻叶片带来的光抑制，从而使水稻秧苗维持较高的光合特性。

3.3 低温锻炼对低温胁迫下水稻秧苗抗氧化能力的影响

增强抗氧化能力是低温锻炼提高植株耐冷性的主要途径之一［19-22］。前人对红掌叶片研究发现，低温锻炼可以通过提高SOD 和CAT 活性及增强POD 的稳定性来减缓红掌叶片膜脂过氧化作用以降低电解质渗出率，从而提高红掌的抗寒性，延长红掌幼苗寒害（4 ℃）致死临界时间［23］。生育前期经过低温锻炼的植株较未锻炼的植株具有较高的能量捕获和电子传递能力，SOD、APX 和CAT 活性增加抑制了光合系统的氧化爆发，减轻了细胞膜脂过氧化伤害，有助于保持低温胁迫下植株的光合碳同化能力和膜稳定性［24］。在本试验中，低温胁迫显著提高了水稻秧苗GPX、CAT和SOD活性和MDA含量，降低了APX和POD活性。而经过低温锻炼的秧苗再次遇到低温胁迫时，其体内CAT、APX和POD活性均较直接低温胁迫处理的秧苗显著上升，GPX 和SOD 活性也有所上升，但差异不显著，此外，经过低温锻炼的秧苗再次遇到低温胁迫时，其MDA 含量的上升幅度也会降低（表4）。这说明低温锻炼处理可以通过增强抗氧化能力提高水稻秧苗的耐冷性。

3.4 低温锻炼对低温胁迫下水稻秧苗耐冷基因表达的影响

低温锻炼上调低温响应相关基因的表达是提高植株耐低温性的重要途径之一。Wang 等［25］发现低温锻炼有效上调了低温胁迫下低温反应基因的表达，导致抗氧化活性和抗氰呼吸能力增加，从而提高小麦植株对低温胁迫的耐受性。Kosova 等［26］的研究也表明，低温锻炼可以通过诱导茉莉酸生物合成酶的基因的表达来诱导内源性茉莉酸的产生，进而提高小麦的耐低温能力。前人研究已证实OsTrx23、OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN都参与水稻的耐低温调节［27-30］。本研究通过测定上述基因的相对表达量，发现低温胁迫下耐冷基因OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN的相对表达量均显著降低，而经过低温锻炼的秧苗再次遭受低温胁迫时，耐冷基因OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN相对表达量仍能维持较高水平（图4）。与OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN不同的是，低温胁迫下耐冷基因OsTrx23的相对表达量会显著提高，而经过低温锻炼的秧苗再次遭受低温胁迫时，OsTrx23的相对表达量会进一步提高（图4），说明耐冷基因OsTrx23在水稻秧苗的低温胁迫过程中更加敏感。

4 结论

低温胁迫会抑制水稻秧苗的生长。前期低温锻炼处理可以通过提高低温胁迫下水稻秧苗的根系活力、叶片水势、叶绿素含量、光系统II 量子荧光效率、抗氧化酶CAT、APX和POD活性及耐冷基因Oslti6a、Oslti6b、OsCOIN和OsTrx23的相对表达量，同时降低MDA 含量来增强水稻秧苗的耐低温能力。