基于消荧光差分拉曼光谱技术预测食用油复热时长

赵 迎 沈学静 李小佳，*

（1钢铁研究总院，北京 100081；2钢研纳克检测技术股份有限公司，北京 100094）

食用油是我国居民饮食中不可或缺的食物原料。新鲜优质的食用油包含了人体所需的多种有益不饱和脂肪酸和维生素，但长时间的高温煎炸、反复多次加热会使不饱和脂肪酸和维生素发生氧化、聚合、异构化等一系列化学变化，产生对人体有毒有害的物质。已有研究表明，在高温下反复加热会降低食用油不饱和脂肪酸含量，增加饱和脂肪酸、硬脂酸、反式脂肪酸的含量。其中，反式脂肪酸（tallow fatty acid，TFA）对人体危害较大，Cam 等［1］研究发现，长期摄入反复加热食用油后，小鼠体内的基因表达状况会发生改变，增加乳腺癌的发病风险；此外，研究发现反式脂肪酸会对青少年中枢神经系统的生长发育造成不良影响［2-4］。

为提高餐饮服务食品安全水平，保障消费者身体健康，规范生产经营行为，国家制定了《餐饮服务食品安全监督管理办法》等相关法律法规［5-8］，极大程度地保障了食用油市场安全，但一些不良企业受利益驱使，无视国家法律，油炸用油的使用时长远超过相关规定。此外，在日常监督方面，我国监管部门依然沿用传统经验检查法，缺少此方面的快速检验方法，监督抽查的针对性不强、筛查能力下降；在检测能力方面，现行食用油国家检测标准仅适用于未使用过的油品，且国标方法检测时间长，有毒试剂用量大，无法判断是否为复热油品；从检验方面看，监督检验周期太长、效率太低，而且依照常规检验方法无法快速查明造假、变质等问题，导致监督检验的时效性不高、支撑力度不够，无法为稽查提前或及时采取行政控制措施提供依据。因此，亟需一种可快速、准确鉴别食用油复热时长的方法［9-14］。

基于检测分子结构等信息的振动光谱技术，是被公认为判定食用油加热时长的最佳检测技术。拉曼光谱分析技术和红外光谱分析技术同为振动光谱分析技术，具有无污染、分析速度快、无损、现场、提供物质的指纹图谱等特点，已广泛应用于食品等行业。目前已有红外光谱分析技术用于食用油加热时长分析的研究，而拉曼光谱在复热食用油方面的研究很少。与红外光谱对非对称振动模式和极性基团的振动更有可能表现出显著红外吸收不同，对称振动模式通常会引起强烈的拉曼散射，因此，采用拉曼光谱技术可以观察到样品的其他振动模式。此外，采用拉曼光谱法可有效检测食用油在加热氧化过程中C=C 键和脂质碳骨架的化学变化，且光谱特征更为显著，从而对食用油多次复热总时长进行有效判别［15-20］。

在检测食用油过程中，常规拉曼光谱不可避免地受到荧光光谱背景干扰［21-22］；尤其是基底较为复杂的食用油样品，在加热过程中，其荧光背景随加热时长变化［23］，导致后续数据模型的准确度降低。因此，采用合理的消荧光技术是建立基于拉曼光谱技术鉴别复热油预测模型的前提。基于此，本研究尝试采用消荧光差分拉曼光谱技术实现4 种常用植物油复热时长的预测，自主研制消荧光差分拉曼检测系统，分析并对比4种植物油的拉曼光谱，对比分析小波变换去背景拉曼光谱与消荧光差分拉曼光谱的主成分分析结果，采用偏最小二乘回归（partial least-squares regression analysis，PLSR）方法分别建立4 种植物油复热时长的预测模型［16，24］，并对预测结果进行分析和对比，以期为食用油复热时长快速定量研究提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验以市售优质品牌的4种植物油为分析对象，详细信息见表1。分别取4 种植物油各20 mL 置于烧杯中，将电加热板温度设置为250 ℃，温度波动不超过2 ℃。当电加热板温度达到250 ℃后，将烧杯放置于电加热板上，预热1 min后开始计时，每加热6 h后关闭电加热板，使其温度自然降至室温，从烧杯中取2 mL样品置于样品瓶中，共加热3次，总加热时长为18 h，样品加热周期不超过3 d。共获得0、6、12、18 h 加热时长的4 种植物油样品。

表1 植物食用油样品详细信息Table 1 Vegetable oil sample details

1.2 主要仪器与设备

研制自主知识产权的消荧光差分拉曼光谱检测系统，整机结构及整机外观如图1 所示。激光器出射的激光经线滤光片，去除等离子射线后，由双胶合聚焦透镜聚焦，垂直作用于样品；样品置于载物台上，通过挟持工装固定，并可以调节物镜与样品之间的距离；激光与样品作用产生的拉曼散射光谱由双胶合聚焦透镜收集，截止滤光片滤除瑞利散射干扰后，经双胶合聚焦透镜收集耦合进光谱仪进行分光和采集。试验前，采用氖元素灯校准光谱仪波长的准确性，采用标准硅片校准激光器中心波长，采用标准光源校准光谱强度。

图1 差分拉曼光谱检测系统示意图及仪器Fig.1 Schematic diagram of the shifted excitation raman difference spectroscopy system

消荧光差分拉曼光谱检测系统采用双波长784.5 nm&785.5 nm半导体激光器作为激发光源，输出功率0 mW至500 mW 连续可调，且具有差分拉曼光谱工作模式和常规拉曼光谱工作模式。在差分拉曼光谱模式下，对待测样品进行双波长激光的拉曼光谱采集，并重建差分拉曼光谱；在常规拉曼光谱模式下，使用单一波长激光对样品进行拉曼光谱采集。

1.3 试验方法

试验前，消荧光差分拉曼光谱检测系统需预热10 min，测试条件：物距38.5 mm，积分时间1 s，积分次数5 次，激光功率450 mW。首先，分别使用差分拉曼光谱模式和常规拉曼光谱模式对样品进行检测，每个样品分别采集100 组原始拉曼光谱及100 组差分拉曼光谱。然后，对采集的拉曼光谱进行小波变换处理及差分拉曼恢复处理。最终，每种样品分别得到3 种类型的拉曼光谱数据：常规拉曼光谱数据、小波变换去背景拉曼光谱数据及消荧光差分拉曼光谱数据。

2 结果与分析

2.1 植物油的拉曼光谱分析结果

4 种植物油的原始拉曼光谱如图2 所示。结果表明，植物油的原始拉曼光谱均受到不同程度的荧光背景影响。荧光背景强度的差异主要由不同厂家制油工艺及样品原料所致。植物油的原始拉曼光谱特征峰位相同、峰形近似，说明不同种类植物油的主要成分结构相似，而拉曼特征峰强度的差异则是由样品中成分含量比例不同所致。

植物油的原始拉曼光谱特征峰代表不同组分的官能团振动信息，其中，868 cm-1及1 078 cm-1分别为—（CH2）—基团的骨架伸缩振动；969 cm-1为RHC=CHR基团的C=C弯曲振动；1 265 cm-1及1 652 cm-1为RHC=CHR 基团的C=C 的伸缩振动；1 295 cm-1为—CH2的卷曲振动；1 442 cm-1为—CH2的剪式振动；1 742 cm-1为RC=OOR基团的C=O伸缩振动；2 847 cm-1为—CH2du对称伸缩振动；2 907 cm-1为—CH2反对称伸缩振动；2 992 cm-1为RHC=CHR 基团的=C—H 对称伸缩振动［25-30］。

不同加热时长植物油的拉曼光谱如图3 所示。结果表明，随着复热时长的增加，4 种植物油的荧光背景呈现一致的下降趋势，这是由于加热导致荧光分子结构被破坏，从而降低了荧光背景强度。由于加热过程中荧光背景的变化为多种荧光物质变化的整体结果，荧光背景来源较为复杂，无法对荧光背景振动模式进行分析和有效归属，因此，基于原始拉曼光谱数据难以实现植物油复热时长的有效检测，需将荧光背景扣除后，基于拉曼光谱特征峰的变化进行植物油复热时长判定方法开发。

图3 不同加热时长的植物油原始拉曼光谱Fig.3 Raman spectra of vegetable oil with different heating time

2.2 基于小波变换扣背景算法的食用油复热时长定量模型

采用小波变换扣背景算法对原始拉曼光谱数据进行处理，选用db4小波函数，分解次数为5次重构，得到荧光背景扣除后的拉曼光谱（图4）。结果表明，4种植物油加热时长的不同导致拉曼特征峰出现了明显变化，这是由加热过程中分子降解、顺式脂肪酸和反式脂肪酸含量变化所致。局部放大的拉曼特征峰强度变化趋势与加热时长呈不一致现象，可能是由小波变换扣背景算法引起。此外，花生油、葵花籽油及大豆油荧光干扰较大，在低波数范围内，荧光背景难以用小波变换扣背景算法完全消除。

图4 经小波变换扣背景处理的植物油拉曼光谱Fig. 4 Raman spectra of vegetable oil with different reheating time treated by wavelet transform

进一步探究不同复热时长是否存在差异及聚类现象，选取600～3 000 cm-1光谱范围内的所有拉曼特征峰信息进行主成分分析，考察聚类分析后是否能够有效区分不同复热时长，计算结果的前2 主成分空间分布如图5 所示。4 种不同加热时长植物油的前两组主成分分量分布已展现出明显聚类特性，但较分散且存在交叉情况。为实现油品复热时长的定量分析，基于多项式线性拟合方法对其进行复热时长的定量分析。采用均方根误差确定最佳因子数，结果表明，最佳主因子数取20，累计贡献率为89%（图6）。

图5 小波变换扣背景处理的4种植物油拉曼数据的主成分分析结果Fig.5 The results of principal component analysis of four kinds of vegetable oil raman data which are processed by wavelet transform and background subtraction

图6 不同主因子数的预测残差平方和Fig.6 RMSE of oil with different principle factor numbers

在主成分分析基础上，结合偏最小二乘回归分析方法，选取主成分变换后前20 组变量，将每种复热时长植物油取50 组拉曼光谱数据作为训练集，得到复热时长定量模型如图7 所示。样品编号1～50 为未复热样品、51～100为累计复热6 h样品、101～150为累计复热12 h样品、151～200为累计复热18 h样品。

图7 经过小波变换扣背景处理拉曼数据的偏最小二乘回归分析结果Fig.7 The results of a partial least squares regression analysis of raman data which are processed by wavelet transform and background subtraction

由图7 可知，基于小波变换算法扣除背景后的原始拉曼光谱建立的偏最小二乘回归定量分析模型测试值和4 种植物油的复热时长呈线性梯度关系。将每种复热时长植物油剩余的50 组拉曼光谱数据作为验证集，分别计算训练集R2、验证集R2、训练集均方根误差（root mean square of calibration，RMSEC）、验证集均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP），结果见表2。基于小波变换算法扣除背景后的原始拉曼光谱建立的偏最小二乘回归定量分析模型，虽然可以预测食用油复热时长，但训练集及验证集的均方根误差较大，表明食用油复热时长定量模型的精确度较低。

表2 植物油的预测模型结果Table 2 The results of prediction models for vegetable oils

2.3 基于差分拉曼光谱技术的食用油复热时长定量模型

差分拉曼光谱如图8 所示。与原始光谱经小波变换扣除荧光背景相比，差分拉曼技术可在全谱范围内有效去除荧光背景干扰。随着复热时长增加，4 种植物油的局部放大拉曼特征峰强度变化趋势与加热时长相关，这是由于植物油加热过程中成分含量的变化导致。

图8 不同加热时长植物油的差分拉曼光谱Fig.8 Differential raman spectra of vegetable oils with different heating lengths

进一步探究基于差分拉曼光谱技术的不同复热时长是否存在差异及聚类现象，选取600～3 000 cm-1光谱范围内的所有拉曼特征峰信息进行主成分分析，考察聚类分析后是否能够有效区分不同复热时长，计算结果的前2 主成分空间分布如图9 所示。与小波变换扣背景算法主成分对比，经过差分拉曼技术处理的4 种不同加热时长植物油的前两组主成分分量集中度有所改善，且不同加热时间分量基本可以区分。

图9 植物油差分拉曼光谱的主成分分析结果Fig.9 Principal component analysis of differential raman spectroscopy of vegetable oil

为实现油品复热时长的定量分析，将主成分分析与多项式线性拟合方法结合，进行复热时长的定量分析。采用均方根误差确定最佳因子数，结果如图10 所示，最佳主因子数取6，累计贡献率为98%。

图10 不同主因子数的预测残差平方和Fig.10 RMSE of oil with different principle factor numbers

同样采用偏最小二乘回归分析方法，以600～3 000 cm-1光谱范围内的所有拉曼特征峰强度参与运算，多项式变量设置为6，将每种复热时长植物油取50组差分拉曼光谱数据作为训练集，得到复热时长定量模型如图11所示。

图11 差分拉曼光谱的偏最小二乘回归分析结果Fig.11 The results of partial least squares regression analysis of differential raman spectra

由图11 可知，基于消荧光差分拉曼光谱技术建立的偏最小二乘回归定量分析模型测试值和4 种植物油的复热时长呈明显线性关系，与原始光谱经小波变换扣除背景算法相比，其波动小、误差低。将每种复热时长植物油剩余的50 组差分拉曼光谱数据作为验证集，分别计算训练集R2、验证集R2、训练集RMSEC、验证集RMSEP，结果见表3。与原始光谱经小波变换扣除背景算法相比，基于差分拉曼光谱技术建立的偏最小二乘回归定量分析模型训练集R2及验证集R2均有所提高，训练集及验证集的均方根误差均降低，表明基于差分拉曼光谱技术可以有效提高定量模型的稳定性和精确度。

表3 植物油的预测模型结果Table 3 The results of prediction models for vegetable oils

3 讨论

本研究将消荧光差分拉曼光谱技术应用于植物油复热时长有效定量检测分析，为食用油复热时长快速检测方法研究提供了参考和借鉴。结果表明，原始拉曼光谱通过小波变换算法处理，可以在一定程度上消除荧光背景干扰，但基于此建立的植物油复热时长回归定量分析模型稳定性和精确度较低。在自主研制的差分拉曼光谱检测系统基础上，基于消荧光拉曼光谱建立的植物油复热时长回归定量分析模型，其稳定性和精确度均有明显提升，这与方方等［31］将差分拉曼光谱技术应用于化妆品中非法添加唑类抗真菌药物定量研究结论一致。在食用油中反式脂肪酸含量检测上，于慧春等［32］和付晓雅［33］分别采用常规拉曼光谱技术结合（non-information variable elimination combined with the support vector regression，UVE-SVR）算法实现了食用油中反式脂肪酸（trans fatty acids，TFAs）含量的检测，TFAs含量与食用油复热时长相关，这在一定程度上验证了拉曼光谱技术用于食用油复热时长定量的可行性，但其玉米油定量模型的相关性系数最高为0.958 5，有待进一步提升。在其他检测方法上，Li 等［34］和刘雨琪［35］分别基于近红外光谱技术对食用油中TFAs含量进行了测定，但该方法数据量较大，计算繁琐，且近红外光谱技术难以适用于远程在线检测场景。

本研究仅选用了固定的复热温度，并未探究温度变化因素对模型的影响，下一步研究需对温度变化影响进行探究。其次，本研究仅针对了4 种植物油，后续可以增加植物油品类。

4 结论

本研究分别采用常规拉曼光谱及差分拉曼光谱对4 种植物油复热时长定量进行分析，结果表明，常规拉曼光谱受荧光背景干扰严重，难以实现植物油复热时长有效定量检测。通过小波变换算法处理，虽然可以基本消除荧光背景干扰，但算法会对拉曼光谱信号造成影响，基于此建立的偏最小二乘回归定量分析模型，虽然能够对植物油复热时长进行定量分析，但模型定量准确度及精度较差。在完成自主研制的差分拉曼光谱检测系统基础上，创新性地将差分拉曼光谱技术应用于植物油不同复热时长定量检测中，该方法不仅简化了预测模型，而且明显提高了模型定量分析能力的精确度，为植物油复热时长定量快速检测提供了一种可行的方法。