广西不同产地肉桂6种药效成分HPLC含量测定及评价

郑美玲,韦壹灵,朱秋莲,梁 俊,黄 博,黎保序*

(1.广西壮族自治区食品药品检验所,广西南宁 530001;2.广西中医药大学,广西南宁 530200;3.玉林市农产品和农机安全检测中心,广西玉林 537516;4.广西泰格瑞科技有限公司,广西南宁 530007;5.广西益谱检测技术有限公司,广西南宁 530007;6.广西智标云信息科技有限公司,广西南宁 530007)

中药肉桂为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥树皮,国内分布在福建、广东、广西、云南等地,主产于广西、广东、云南[1],而广西是国内肉桂药材的原产地和最大的产区,主要分布在桂平、平南、防城和岑溪等地[2]。肉桂可药食两用,具补火助阳、引火归元、散寒止痛、温通经脉之功效,用于治疗腰膝冷痛、虚阳上浮等[3-5],肉桂中化学成分复杂,药效作用受组分间相互影响,单一成分难以合理评价肉桂的质量[6-7]。因此对其不同产地药材药效成分含量评价是肉桂药材急需解决及开展的研究之一。研究证明肉桂药材的主要活性成分是挥发油,而挥发油中主要成分为桂皮醛和肉桂酸[8]。该研究利用HPLC测定广西不同产地肉桂中桂皮醛、肉桂酸、肉桂醇、邻甲氧基肉桂醛、香豆素、2-羟基肉桂醛等6种药效成分的含量[9],可初步确定不同产地肉桂中6种药效成分含量水平;同时参照2020年版《中华人民共和国药典》一部肉桂药材检测项下要求,结合聚类分析对收集自广西多个产地的43批次肉桂药材进行药效成分评价,按产地进行分类[6],为广西不同产地肉桂质量评价及控制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1仪器。Ultimat 3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司);FS-100型粉碎机(鹤壁市英泰电子电器有限公司);FR2224CN型电子天平[奥豪斯仪器(常州)有限公司,精度0.01 g];AUW120D型分析天平(日本岛津公司,精度0.01 mg);SF-TGL-16M型离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.2试剂。桂皮醛(CDAA-280568,纯度99%)、香豆素(CDAA-280338,纯度99%)、肉桂醇(CDAA-280569,纯度99%)、肉桂酸(CDAA-280566,纯度99%)标准样品(上海安普实验科技股份有限公司);2-羟基肉桂醛(Lot6593,纯度≥98%)、邻甲氧基肉桂醛(YT20071203,纯度99%)标准样品(Stanford Analytical Chemicals Inc);乙腈(色谱纯,北京迈瑞达科技有限公司);甲醇(色谱纯,北京迈瑞达科技有限公司)。

1.1.3肉桂样品。从广西平南、桂平、岑溪、藤县、东兴、防城等不同产区采集 43批次肉桂药材,规格均为桂通,所有样品无霉坏和虫蛀。经广西壮族自治区林业科学研究院肉桂所李军集高级工程师鉴定为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥树皮。样品信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1标准样品溶液的制备。分别取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛对照品适量,精密称定,分别置10 mL容量瓶中,加入70% 甲醇至刻度,摇匀。分别得7 413.0、2 000.0、5 625.0、1 112.0、1 635.0、1 156.0 μg/mL 的对照品储备液。

分别取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛对照品储备液100、400、100、400、400、400 μL 置于同一25 mL容量瓶中,用70% 甲醇定容,得到浓度为32.000、17.792、26.160、18.496、29.652、22.500 μg/mL的肉桂醇、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛、桂皮醛、肉桂酸混合对照品使用液。

1.2.2样品溶液的制备。分别取广西不同产地的肉桂样品进行粉碎,过三号筛,得肉桂粉末。精密称定0.5 g肉桂粉末移入50 mL离心管,加入25 mL 70%甲醇,超声30 min(功率350 W,频率35 kHz),超声过程适当换水避免温度过高。离心,取上清液至50 mL容量瓶中。精密加入10 mL 70%甲醇溶液至有残渣的离心管内,同法超声处理一次,离心,将上清液转移至同一容量瓶中,70%甲醇定容,摇匀。0.22 μm有机滤膜过滤,待测。

1.2.3色谱条件。色谱条件参照2020版《中国药典》和相关文献[10]进行调整。色谱柱为XTERRA® MS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)(洗脱梯度:0～1 min,25% A;1～15 min,25%→38% A;15～35 min,38%～45% A);波长265 nm;柱温25 ℃;流速0.8 mL/min;进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1线性关系的考察。分别精密吸取混合对照品使用液16.8、33.0、67.0、168.0、337.0 μL加入1 mL 70%甲醇中稀释,得到5个不同浓度的混合对照品溶液,第6个浓度直接取1 mL置进样瓶中,一共得到6个浓度的混合对照品溶液。按色谱条件进样,以浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘图,得到各成分回归方程,结果表明(表2),各成分的线性关系良好(r≥0.999 3),可用于肉桂样品中药效成分的测定。

表2 6种成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.1.2精密度试验。分别精密称取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛对照品,按“1.2.1”制备,按“1.2.3”色谱条件连续进样,进行色谱测定。从表3可以看出,各成分相对保留时间RSD在0.06%～ 0.19%,相对峰面积RSD在0.15%～ 3.90% ,表明仪器精密度良好。

表3 6种成分含量测定精密度

2.1.3重复性试验。分别精密称取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛对照品,按“1.2.1”制备,按“1.2.3”色谱条件连续进样,进行色谱测定,记录峰面积,按峰面积计算各成分含量。从表4可以看出,各成分含量RSD在0.63%～ 4.30%,表明该测定方法重复性良好。

表4 6种成分含量测定重复性

2.1.4稳定性试验。分别精密称取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛对照品,按“1.2.1”制备,按“1.2.3”色谱条件连续进样,进行色谱测定。分别于0、2、4、8、16、24 h测定,结果发现(表5～6),各成分相对保留时间RSD在0.01% ～0.10%,相对峰面积RSD均0.09%～2.20%,表明样品溶液在24 h内稳定。

表6 6种成分含量测定相对峰面积稳定性

2.1.5加样回收率试验。精密称取已知6种成分含量肉桂对照样品0.25 g,平行6份。每份分别加入桂皮醛储备液(7 413.0 μg/mL)2.5 mL、肉桂醇储备液(2 000.0 μg/mL)1.0 mL、香豆素储备液(1 112.0 μg/mL)0.1 mL、肉桂酸储备液(5 625.0 μg/mL)0.5 mL、邻甲氧基肉桂醛储备液(1 635.0 μg/mL)0.5 mL、2-羟基肉桂醛储备液(1 115.6 μg/mL) 0.2 mL,按“1.2.1”制备,按“1.2.3”色谱条件连续进样,进行色谱测定,计算各成分的回收率及 RSD值。结果发现(表7),各成分不同加样量回收率在96.8%～103.2%,RSD在1.0%～2.0%,表明该方法回收率良好。

表7 6种成分加样回收试验结果

2.2 肉桂样本药效成分含量测定6种药效成分标准样品和不同产地批次肉桂样品均按“1.2.2”制备供试液,按“1.2.3”色谱条件测定。 265 nm 波长下,确定6种药效成分标准样品6个共有峰,根据药效成分色谱图对不同肉桂样品指认出6个色谱峰,分别是2-羟基肉桂醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、邻甲氧基肉桂醛(图1)。

注:1为2-羟基肉桂醛;2为香豆素;3为肉桂醇;4为肉桂酸;5为桂皮醛;6为邻甲氧基肉桂醛。Note:1 is 2-hydroxyl cinnamaldehyde;2 is coumarin;3 is styrone;4 is cinnamic acid;5 is cinnamaldehyde;6 is 2-methoxy cinnamaldehyde.

从表8可以看出,广西不同产地肉桂药材中6种药效成分含量存在一定差异,其中桂皮醛在所测成分中含量占比最大,岑溪(RG-18～RG-24)和东兴地区(RG-35～RG-38)肉桂样品中桂皮醛含量较高,平均含量分别为48.448 3、45.118 1 mg/g,其他产区间桂皮醛平均含量差异较小;不同产区肉桂中邻甲氧基肉桂醛和香豆素的含量相差较大,邻甲氧基肉桂醛平均含量最高在桂平产区(RG-10～RG-17),为3.022 8 mg/g,平均含量最低产区在防城区(RG-39～RG-43),仅为0.380 6 mg/g。2-羟基肉桂醛含量很低,属于微量、痕量成分,含量在 0.006 0～0.281 6 mg/g,产地间平均含量差异不大。但在进行方法学考察时,因2-羟基肉桂醛含量极低,导致2-羟基肉桂醛的精密度、重复性、稳定性试验相对峰面积RSD均较大。

表8 不同产地肉桂药效成分含量测定结果

2.3 广西不同产地肉桂图谱相似度评价及聚类分析

2.3.1不同产区肉桂HPLC图谱相似度评价。试验结果表明,广西不同产地肉桂药材中6种药效成分含量存在一定差异,其中桂皮醛含量占比最大,利用“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统 2012 年 A 版”软件[11],对不同产区肉桂HPLC图谱进行叠加可以直观看出各成分在含量上有一定差异,见图2。

注:1为2-羟基肉桂醛;2为香豆素;3为肉桂醇;4为肉桂酸;5为桂皮醛;6为邻甲氧基肉桂醛。Note:1 is 2-hydroxyl cinnamaldehyde;2 is coumarin;3 is styrone;4 is cinnamic acid;5 is cinnamaldehyde;6 is 2-methoxy cinnamaldehyde.

2.3.2不同产地肉桂图谱相似度评价及聚类分析。利用不同产区肉桂中6种药效成分的测定值对产区进行聚类分析[12]。使用SPSS 20.0统计软件,采用组间聚类方法[13],结果见图3。根据聚类分析结果,43批肉桂药材可以分为2大类,RG-18、RG-36、RG-22归为 Ⅱ 类,其余批次归为 Ⅰ 类,并未呈现出地域间的聚类效果,原因可能是各产地气候、土壤等环境因素有相似之处,引起不同产地间桂皮醛等6种药效成分含量比例类似导致。

图3 不同批次肉桂药效成分聚类分析Fig.3 Cluster analysis of medicinal components of cinnamon from different batches

3 讨论

该试验中供试品制备方法提取的广西不同产地的桂皮醛含量高于《中华人民共和国药典》规定的1.5%,且方法学考察结果均佳,适合作为同时测定桂皮醛、肉桂酸、肉桂醇、香豆素、邻甲氧基肉桂醛、2-羟基肉桂醛含量的供试品溶液制备方法。

该试验测定结果与2020版《中华人民共和国药典》肉桂项下桂皮醛测定结果有不同之处,桂皮醛等6种药效成分测定结果显示岑溪地区肉桂中桂皮醛含量最高,其次为东兴地区,可能与提取方式和色谱条件有关,因此在测定多种成分含量时应注意考察提取方式和色谱条件[14],为测定肉桂成分提供便捷可行的测定方法。

肉桂中化学成分丰富,除桂皮醛成分外,其他成分含量较低,中药发挥疗效是多种成分共同作用的结果,因此肉桂质量评价需要综合多成分含量及成分间内在联系来评价。