基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术的急性百草枯中毒患者早期血浆代谢组学研究*

杨娜,张天祺,蒋陈晓,2,罗雪梅,朱怀军,王敏

(南京大学医学院附属鼓楼医院1.药学部;2.急诊医学科,南京 210008)

百草枯是一种季铵盐类高效、广谱除草剂,其在土壤中发挥作用后可很快失去活性[1]。然而,百草枯对人体毒性很强,经口摄入后致死率60%～80%[2]。百草枯可造成人体多处脏器损伤[3],其中肺部病变及功能受损最为显著[4]。急性中毒症状可在1 d内出现肺水肿,1～3 d内出现急性呼吸窘迫综合征,部分患者度过急性期后可在1～2周内发生肺间质纤维化,最终导致呼吸衰竭[5]。少数患者即使存活,肺部功能也严重受损且生活质量下降[6]。百草枯尚无特效解毒剂,其毒性机制尚不明确,且临床研究匮乏。即使采取多种处理措施也很难改善预后,中毒程度较轻的患者,采取适当急救措施即可有很高的生存率[7-8]。因此,早期预测对于急性期采取合理的治疗措施具有很高的指导意义[9]。近年来,pentraxin-3等相关血液指标对百草枯中毒预后的预测价值引起关注[10]。 笔者拟通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)对百草枯中毒患者早期血浆进行代谢组学研究,旨在进一步了解百草枯急性中毒的早期相关机制,并寻找潜在的预后参考生物标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集南京大学医学院附属鼓楼医院药学部百草枯中毒患者早期血浆检测样本12例。纳入标准:①误服百草枯中毒后24 h内血浆样本;②百草枯浓度测定值大于定量限。排除标准:①患者合并恶性肿瘤;②患者合并重要脏器功能障碍性疾病;③患者中毒前服用其他药物或毒物。对照组样本为健康人群血浆样本12例。

1.2仪器及试剂 Exion LC AD超高效快速液相色谱(美国 AB SCIEX公司);TripleTOF 5600+型高分辨质谱(美国 AB SCIEX公司);TGL-16.5M冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);DW-HL340超低温冰箱(Thermo Fisher公司,美国),乙腈(色谱纯,德国Merck公司)。

1.3色谱条件与质谱条件 色谱条件:Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm);柱温:40 ℃;进样器温度:4 ℃;流动相为水相(A):0.1%甲酸溶液,有机相(B):乙腈。梯度洗脱程序如下:0.0～1.0 min,10%～30%(B);1.0～19.0 min,30%～95%(B);19.0～20.0min,95%(B);20.0～25.0 min,95%～10% (B)。流速为0.4 mL·min-1,进样体积为5 μL。

质谱条件:电喷雾离子源,采用正、负离子监测模式;正负电压:5 500 V/-4 500 V;离子源温度550 ℃;雾化气压力:379.2 kPa;辅助加热气压力:379.2 kPa;气帘气压力:241.3 kPa;去簇电压:±80 V;碰撞能为35 V,碰撞能分散度15 V;一级质谱全扫描范围为100～1000 Da;动态背景扣除模式;采用信息依赖采集 (nformation-dependent acquisition,IDA) 模式对符合IDA标准的离子进行MS/MS碎片离子采集。

1.4样本制备 各组平行取血浆样本40 μL,分别加入冰乙腈160 μL,涡旋振荡5 min,高速离心(4 ℃,14 000 r·min-1,10 min,r=8.6 cm)2次后,取上清液100 μL于进样小瓶进行UPLC-QTOF-MS分析,进样体积5 μL。

1.5质谱数据分析流程 UPLC-QTOF-MS原始数据文件采用开源数据处理软件XCMS,对数据进行保留时间校准、峰滤噪、峰识别、及峰对齐。对包含质荷比、保留时间、峰面积等信息的二维数据阵进行分析。参照质控数据筛选原则、缺失值填补、数据归一化及标尺化处理后,将筛选出的变量导入SIMCA-P 13.0版软件(Umetrics,瑞典),并进行主成分分析(principle component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminate analysis,OPLS-DA)。 差异代谢物筛选选取OPLS-DA模型VIP参数值>1和显著性差异P<0.05的变量,同时满足差异倍数(fold change,FC)<0.833或>1.2,经人类代谢组数据库鉴定。对差异代谢物导入MetaboAnalyst采用热图(Heatmap)分析。

2 结果

2.1两组人群人口统计学资料比较 共入组血浆样本24例,其中误服百草枯中毒后24 h内血浆样本和健康对照人群血浆样本各12例,见表1。两组人群性别、年龄构成一致,肾功能指标肌酐、尿酸以及肾小球滤过率(glomeruar filtration rate,GFR)均差异无统计学意义。两组天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)比较差异无统计学意义,但组内个体差异大。百草枯中毒组丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平显著高于对照组。

表1 两组人口统计学资料比较

2.2主成分分析PCA 本研究基于前期方法[11],采用UPLC-QTOF-MS对两组人群进行血浆代谢组学分析。对质量控制(quality qontrol,QC)样本总离子流(total ionchromatogram,TIC)图叠加后显示随行 QC 样本色谱轮廓图变异小、重叠度高(图1),说明本试验建立的 UPLC-Q-TOF/MS方法在样本进样分析过程中具有较好的稳定性。通过XCMS软件对色谱峰进行提取校准后正离子和负离子模式下分别得到色谱峰2 214和2 053个。经80%去零规则消除缺失值、数据归一化及标尺化处理后,进一步进行PCA分析。PCA图中每个点代表血浆代谢组成成分的得分。通过PCA得分图可观察样本的聚集、离散及离群点,样本点靠的越近说明代谢组组成越接近,而离的越远说明样本间代谢组差异越大。见图2。结果显示,QC样本点聚集良好,证明该分析方法具有良好的可重复性。正离子模式计算出R2X(cum)=0.668,Q2(cum)=0.504;负离子模式计算出R2X(cum)=0.672,Q2(cum)=0.494。百草枯中毒组较健康对照组呈现一定的分离度,且中毒组PCA得分图显示出较大的个体差异。

图1 质量控制样本的总离子流重叠图

图2 血浆样本PCA和OPLS-DA结果

2.3OPLS-DA分析 进一步采用OPLS-DA对百草枯中毒和健康人群的血浆样本进一步区分,见图2。百草枯中毒和健康人群血浆互相分离,代谢轮廓有明显区别。预测成分对差异的解释水平(正离子模式:R2Y=0.983;负离子模式:R2Y=0.978)和预测水平(正离子模式:Q2=0.77;负离子模式:Q2=0.71)较好。通过200次置换检验计算出每组截距,其中正离子模式下模型参数R2=0.874,Q2=-0.405;负离子模式下模型参数R2=0.867,Q2=-0.398,其数值均<1,判定模型稳定可靠,预测性好,不存在过拟合。

2.4差异代谢物筛选与分析 基于OPLS-DA模型,比较两组人群血浆中的差异代谢物,选取VIP参数值>1、显著性差异P<0.05并同时满足FC<0.833或>1.2的变量,经二级谱库对差异化合物进行精确鉴定分析,见表2。正、负离子模式下共筛选出差异化合物48个,包含磷脂、氨基酸、饱和或不饱和脂肪酸等。采用MetaboAnalyst5.0对差异代谢物进行通路富集分析后发现,主要涉及亚麻酸和亚油酸代谢、磷脂酰乙醇胺合成、同型半胱氨酸降解等通路。对代谢物的水平分析发现,中毒组血浆中脂肪酸及磷脂[溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)]等变化显著(P<0.05),见图3。采用火山图结合统计显著性量度(P值)和变化幅度(倍数)进一步分析显示,有23种差异化合物在两组中变化超过2倍(图4A),包含8种不饱和脂肪酸、6种磷脂、2种氨基酸等。其中LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)变化最为显著,在百草枯中毒组血浆中水平比健康对照组分别高16.2倍(P<0.05)和17.9倍(P<0.05),其他差异代谢物变化均在4倍以内。亚油酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、LysoPC(16：0) 和LysoPC(17：0) 在百草枯中毒组血浆中水平显著低于健康对照组。

N01—N12:健康对照组;B01—B12:百草枯中毒组。

A.中毒及对照组差异化合物火山图; B.L-乳酸;C.二十碳二烯酸;D.4-羟丁酸;E.甜菜碱;F.苯丙氨酰苯丙氨酸;G.1-磷酸鞘氨醇;H.溶血磷脂(20：1);I.溶血磷脂酰乙醇胺(22：6)。①与存活组比较,t=3.26～3.54,P<0.01;②与存活组比较,t=2.33～2.71,P<0.05。

表2 两组人群差异代谢物

百草枯中毒组12例患者中有6例出现急性百草枯中毒后死亡。进一步分析发现,百草枯中毒组较健康对照组血浆中显著变化的48种差异化合物中,有8种化合物在中毒存活和死亡亚组中差异显著,见图4。除苯丙氨酰苯丙氨酸外,包括LysoPE(22：6)、LysoPC(20：1)、L-乳酸、二十碳二烯酸、4-羟丁酸、甜菜碱、1-磷酸鞘氨醇在内的7种化合物在中毒死亡组中水平显著高于存活组。值得一提的是,LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)变化同样最为显著,在死亡组中水平分别为存活组水平的14.5倍(P<0.05)和16.4倍(P<0.01)。以上提示,二者在百草枯急性中毒及致死相关毒性机制中发挥重要作用。

3 讨论

目前针对百草枯中毒尚无特效解毒剂,对于其中毒预后的早期评估对临床采取合理措施具有一定指导意义。代谢组学是系统生物学的重要组成部分,是一种研究生物系统受到刺激后代谢产物的变化或其随时间变化的一种技术手段[12]。近些年来,代谢组学技术在疾病预后评估、药物/毒物作用机制及干预靶点发现等多方面广泛应用[13-14]。现阶段,由于急性百草枯中毒较为罕见,临床样本较难获得,针对百草枯中毒后的代谢组学研究多集中在动物水平。有研究表明,百草枯中毒大鼠肺组织氨基酸代谢、脂肪代谢等代谢途径可能参与了百草枯中毒致肺损伤的病理进程[15]。其中,棕榈酸、硬脂酸等脂肪酸代谢物变化趋势与本研究中血浆代谢组学结果一致。

研究发现,急性百草枯患者中毒早期血浆中LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)升高最为显著,且死亡患者血浆中水平显著高于存活患者。值得关注的是,二者皆为磷脂类物质。研究表明,LysoPC为强促炎递质,可通过激活和募集黏附分子、生长因子、单核细胞和巨噬细胞来增强炎症,也可通过调节免疫细胞的功能参与免疫反应。在输血或直径≤2.5 μm的颗粒物所致的急性肺损伤过程中,LysoPC水平均显著上调[16]。临床研究还发现,作为促肺纤维化介质溶血磷脂酸的合成前体,血浆LysoPC可作为特发性肺纤维化的潜在生物标志物。以上提示,血浆LysoPC水平与百草枯中毒所致肺功能损害及肺纤维化具有密切关联。血浆LysoPE与肺癌的发生发展密切相关[17-18],LysoPE对于非小细胞肺癌具有较高的诊断效能(AUC:0.78)和灵敏度(94.75%)[19],提示LysoPE与肺部生理病理状态存在密切关联。

不饱和脂肪酸二十碳二烯酸为促炎递质,且血浆不饱和脂肪酸水平与肺功能呈负相关,这与死亡患者血浆中水平显著高于存活患者相一致[20]。本研究还发现死亡患者血浆中包括L-乳酸和4-羟丁酸在内的单羧酸类化合物水平显著高于存活患者。二者是细胞重要的分解代谢产物,同时可作为底物参与到其他生物代谢途径中。二者在血浆中的较高水平不仅说明中毒患者机体处于显著的代谢异常状态,负责其转运的单羧酸转运体(monocarboxylate transporter,MCT)的表达或活性是否存在异常还需要进一步考察,而MCT功能失调被证实与肺、肾脏等多种脏器疾病进程密切相关[21]。与所筛选的其他差异代谢物不同,苯丙氨酰苯丙氨酸被发现在死亡患者血浆中水平显著低于存活患者,有研究表明苯丙氨酰苯丙氨酸可以影响蛋白质的合成和分泌,与内皮细胞功能密切相关[22],而其与急性百草枯中毒后所致的各脏器严重损伤之间的关联还需要进一步探究。

综上所述,本研究通过UPLC-QTOF-MS技术对急性百草枯中毒患者早期血浆进行代谢组学研究,可为急性百草枯中毒预后早期评估提供参考,为中毒所致肺损伤提供新的干预靶点。