广陈皮对功能性消化不良大鼠胃肠动力的影响*

王光宁,史梦娜,黄月,陆旻彤,杨超燕,陈艳芬

(广东药科大学中药学院,广州 510006)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是临床常见的功能性肠胃病,由胃和十二指肠功能紊乱引起的非器质性病变,症状以上腹部不适、饱胀感、胀气等为主,可能与胃肠运动障碍、内脏高敏以及精神心理因素等有关。根据FD的症状和临床表现,可将其划归中医学“痞满”“胃脘痛”等范畴,常用中药有枳壳、柴胡、陈皮等[1-4]。陈皮为芸香科植物橘及栽培变种的干燥成熟果皮经陈化而得,具有理气健脾、燥湿化痰的功效,可用于治疗脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症。广陈皮为橘的栽培变种茶枝柑的果皮,因主产于广东新会也称为新会陈皮,2006年被评为国家地理标志产品。广陈皮含有黄酮、生物碱、挥发油等成分,可作用于消化、心血管及呼吸等系统,具有调节胃肠动力、助消化、祛痰、调节血脂及抗氧化等药理作用[5-9]。广陈皮临床主治脾胃气滞湿阻、脘腹胀痛、不思饮食等症,可用于治疗消化不良[3,10]。陈皮自古强调“陈久者良”,陈化有利于药效的发挥,现代研究发现陈化对主要成分黄酮和挥发油均产生影响。目前广陈皮采用自然存贮法进行陈化,具有耗时长、损耗率高等不足。本项目组采用人工加热法对广陈皮进行模拟陈化,可简便快速地制备陈化样品,前期已对模拟陈化方法进行初步考察。本实验采用多因素应激干预法制造FD大鼠模型,探讨不同陈化时间和方法的广陈皮对FD模型大鼠胃肠动力的影响,并初步探讨促进胃肠动力作用机制,为广陈皮的陈化研究和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体级雄性SD大鼠42只,体质量160～180 g,鼠龄45～50 d,购于广东省医学实验动物中心,动物合格证号:SCXK(粤)2018-0002。饲养环境温度22～25 ℃,相对湿度50%～60%。

1.2药物与试剂 广陈皮购于新宝堂陈皮有限公司,经广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定,为茶枝柑Citrusreticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮。多潘立酮购于西安杨森制药有限公司(批号:181028405)。大鼠5-羟色胺(5-HT)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒和大鼠胃动素ELISA试剂盒均购于江苏酶免实业有限公司(批号分别为MM-0442R1、MM-0491R1)。5-HT4R抗体购于Affinity(批号:33j3022)。RIPA裂解液(批号:G2002)、磷酸化蛋白酶抑制剂(批号:G2007)及二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量检测试剂盒(批号:G2026)均购自Servicebio公司。

1.3仪器与设备 多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司,型号:EPOCH2),病理切片机(上海徕卡仪器有限公司,型号:RM2235),灰度分析软件(Alpha Innotech,alphaEaseFC)。

1.4实验方法

1.4.1药液的制备 广陈皮溶液:分别取干燥的新皮和十年皮,纯化水回流提取2次,每次30 min,过滤,合并滤液,减压浓缩至0.5 g·mL-1。模拟陈化样品用新皮提取浓缩液于烘箱80 ℃加热96 h。以上样品制备好后4 ℃冷藏备用,临用前加纯化水稀释至0.21 g·mL-1。多潘立酮溶液:取多潘立酮(每片10 mg)60 mg,研磨至粉状,溶于0.5%羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液中,制成浓度为0.6 mg·mL-1混悬液。碳糊:称取CMC-Na 1.2 g溶于纯化水120 mL中,依次加入奶粉4.8 g,白砂糖2.4 g,淀粉2.4 g,最后滴入炭素墨水使成黑色半固体糊状物,称定质量,备用。

1.4.2FD大鼠的制备 SD大鼠适应性喂养7 d后开始造模,按照体质量随机分为正常对照组(7只)和模型组(35只)。正常对照组大鼠正常喂养,自由饮水。模型组根据文献采用郭氏夹尾法、不规则喂养和0 ℃、0.9%氯化钠溶液灌胃等多因素应激干预法制造肝郁脾虚FD大鼠模型[11]。具体操作如下:①每只大鼠灌胃0 ℃、0.9%氯化钠溶液2 mL,每天2次。②用长海绵钳夹住大鼠尾尖1/3处,力度以不破皮并能引发打斗为度。每笼每次刺激30 min,激怒大鼠使整笼动物处于愤怒状态。每天2次,中间间隔6 h。如有抓伤可用聚维酮碘溶液涂抹受伤部位。③不规则喂养,即每只大鼠单日给食30 g,双日禁食,每天饮水自由。3种方法联合造模,共持续21 d。造模过程中观察大鼠的体质量、精神状态、毛发和排便情况等,旷场实验评价大鼠的自主活动能力,对模型进行评估。

1.4.3分组及给药 造模结束后,根据大鼠体质量及旷场实验结果将模型大鼠随机分为模型对照组、多潘立酮组、新皮组、十年皮组和模拟陈化组,每组7只。根据陈皮临床人的最大剂量换算大鼠的等效剂量为1.05 g·kg-1,给药剂量设为等效剂量的2倍,即为2.1 g·kg-1。多潘立酮给药剂量为6.17 mg·kg-1。模型对照组用常温0.9%氯化钠溶液灌胃,多潘立酮组灌胃多潘立酮溶液,新皮组、十年皮组和模拟陈化组分别灌胃新皮水提液、十年皮水提液以及加热模拟陈化药液,给药7 d。给药期间,各组正常喂饲,饮水自由。

1.5观测指标 一般状态:每天观测大鼠的体质量、精神、毛发及粪便等。行为学评价:采用旷场实验法观察各组动物在造模和给药期间的自主活动能力。在造模的第14天、第21天和给药7 d分别进行大鼠旷场实验,以大鼠三爪及以上跨进箱内其他方格数的总格子数作为水平活动得分,以大鼠双前肢抬离地面及攀附敞箱四壁的总次数记为垂直活动得分,记录每只大鼠5 min内的行为活动得分。

胃残留率和小肠推进率:末次给药后,所有大鼠禁食不禁水24 h。每只大鼠灌胃碳糊2 mL,30 min后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,分别取出胃和小肠。将胃用滤纸擦净,称量并记录质量。沿胃大弯剪开后用4 ℃、0.9%氯化钠溶液清洗内容物,擦干后称质量。胃质量与胃净质量的差值与碳糊质量的百分比即为胃残留率。取出小肠后分别测量幽门与碳糊的距离和幽门到回盲区的距离,两者比值的百分数即为小肠推进率。

胃窦组织病理观察:取大鼠胃窦组织,用4%多聚甲醛固定,然后脱水、浸蜡、包埋和切片,苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色后观察胃窦组织病理学变化。

胃肠激素含量测定:各组大鼠经腹主动脉采血,收集血液后在室温下静置30 min,于4 ℃离心20 min(3 000 r·min-1,r=8.54 cm),分离血清保存在-80 ℃冰箱中。取各组大鼠血清按照ELISA试剂盒的操作方法分别测定胃动素和5-HT的含量。

蛋白表达:取各组大鼠十二指肠于-80 ℃保存备用。采用Western blotting法测定各组大鼠十二指肠中5-HT4R的蛋白表达,按照操作顺序进行蛋白提取-制胶-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-化学发光-图像分析。

2 结果

2.1一般状态 在造模期间正常对照组大鼠毛发有光泽,行动灵敏,精神状态良好,粪便形态正常。与正常对照组比较,模型组动物从造模第7天开始出现毛发散乱,形体渐瘦,有暴躁、易怒、焦躁不安的倾向,粪便质地稀软,有腥臭味。造模结束后模型组大鼠毛发干枯,形体明显消瘦,精神状态较差,易被激怒,粪便水分含量大,腥臭味明显。与模型对照组比较,各给药组大鼠毛发有光泽,形体恢复明显,精神状态明显好转,活动量增加,粪便形态正常。中医认为过激情绪会伤及肝脾从而导致脾胃不和,现代医学也认为精神心理因素是消化不良的诱因之一,因此本实验在实验过程中观察各组大鼠的精神情绪变化,结果表明多因素应激干预法造模可致大鼠情绪暴躁易怒,给药治疗后精神状态明显改善。

2.2体质量变化 在造模期间,正常对照组大鼠的平均体质量稳定增长,增速较快。与正常对照组比较,模型组大鼠体质量增长缓慢。第21天时模型组与正常对照组的平均体质量相差较大,见图1。表明该造模方法可明显抑制大鼠体质量增加。

图1 大鼠造模期间平均体质量变化趋势

给药1周后,多潘立酮组、新皮组、十年皮组和模拟陈化组的大鼠体质量增长较快,具体见图2。表明给药干预后有助于FD大鼠体质量的恢复。

图2 大鼠给药期间平均体质量变化趋势

2.3行为学得分 与正常对照组比较,造模期间模型组大鼠的水平和垂直得分明显减少,说明多因素应激干预法造模能显著降低大鼠的自主活动水平。见表1。

表1 大鼠造模期间水平和垂直运动得分

综合造模期间一般情况、体质量变化以及行为学评分说明采用郭氏夹尾、不规则喂养和0 ℃、0.9%氯化钠溶液灌胃等方法可较好地制造FD大鼠模型。

由给药后各组大鼠行为学得分结果可知,与正常对照组比较,模型组的水平得分和垂直得分均降低。连续给药7 d后,新皮组、十年皮组以及模拟陈化组大鼠的水平和垂直运动得分均高于模型对照组 [F(5,36)=2.155,F(5,36)=2.027,P<0.05或P<0.01],说明广陈皮能提高FD大鼠的自主活动水平。具体见表2。

表2 大鼠给药后水平和垂直运动得分

2.4胃残留率和小肠推进率 结果见表3。与正常对照组比较,模型对照组大鼠的胃残留率明显上升,小肠推进率明显下降(P<0.05);与模型对照组比较,各广陈皮给药组大鼠的胃残留率下降、小肠推进率升高 [F(5,36)=2.010,F(5,36)=8.891,P<0.05或P<0.01],其中新皮组和十年皮组大鼠的小肠推进率升高明显。

表3 6组大鼠的胃残留率和小肠推进率比较

2.5胃窦组织的病理观察 各组大鼠胃窦组织HE染色病理结果见图3。可知,正常对照组和模型对照组及各给药组均未发现器质性改变,胃窦组织无溃疡及炎性浸润等明显病理特征。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.多潘立酮组;D.新皮组;E.十年皮组;F.模拟陈化组。

2.6胃动素和5-HT含量 各组大鼠血清中胃动素和5-HT含量测定结果见表4。与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清中胃动素和5-HT的含量均明显下降(P<0.05)。与模型对照组比较,各广陈皮给药组大鼠血清中胃动素和5-HT的含量明显升高 [F(5,36)=4.841,F(5,36)=5.032,P<0.05或P<0.01],其中新皮组和模拟陈化组大鼠血清中的胃动素含量显著升高;新皮组和十年皮组大鼠血清中的5-HT含量显著升高。

表4 6组大鼠血清中胃动素和5-HT的含量

2.75-HT4R蛋白表达 见图4。与正常对照组比较,模型对照组大鼠十二指肠中的5-HT4R蛋白表达量下降,各给药组大鼠十二指肠中的5-HT4R蛋白表达量显著升高;与模型对照组比较,各陈皮给药组和多潘立酮组的5-HT4R蛋白表达量显著升高 [F(5,12)=40.378,P<0.05或P<0.01]。表明本实验采用多因素应激干预法造模可下调FD大鼠十二指肠中5-HT4R蛋白表达,广陈皮不同给药组大鼠十二指肠的5-HT4R蛋白表达量显著升高,与正常对照组比较也明显升高,说明广陈皮不仅能回调FD模型大鼠十二指肠的5-HT4R蛋白表达,也可上调正常大鼠的5-HT4R蛋白表达。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.新皮组;D.十年皮组;E.模拟陈化组;F.多潘立酮组。①与正常对照组比较,t=3.952,P<0.05; ②与正常对照组比较,t=-10.157～-5.160,P<0.01;③与模型对照组比较,t=-11.410～-7.443,P<0.01。

3 讨论

中医认为怒伤肝思伤脾,肝木乘脾土,肝气郁结致使胃失和降、脾失健运而出现消化不良,因此本实验采用夹尾刺激可激怒大鼠并引发打斗,结合不规则饮食和0 ℃、0.9%氯化钠溶液灌胃模拟功能性消化不良症状。造模期间,模型对照组大鼠的体质量增长缓慢,暴躁易怒,自主活动明显减少,胃窦组织无明显器质性病变,说明该方法可较好地模拟FD的症状。给药治疗后各给药组的体质量增长明显高于模型对照组,精神状态明显好转,自主活动也明显增加,胃残留率和小肠推进率也明显改善,说明广陈皮可改善FD模型大鼠的消化不良症状,促进胃肠动力。与模型对照组比较,新皮、十年皮组和模拟陈化组均可促进胃排空和小肠推进,新皮和十年皮的促进小肠推进作用更明显。表明不同陈化时间广陈皮对FD大鼠胃肠动力的促进作用差异不明显。

胃肠激素是一类具有调节自身胃肠道运动的特殊小分子肽活性物质,主要由消化系统中的内分泌细胞所分泌。胃动素是消化道常见的激素之一,具有促进胃肠运动作用和分泌作用。各广陈皮给药组均能促进FD大鼠胃动素的分泌,其中新皮促进胃动素分泌作用强于十年皮组,与模拟陈化样品相近。表明广陈皮可通过促进胃动素分泌增强胃肠动力,与文献报道结果一致[12]。

5-HT是一种广泛存在于中枢神经系统和胃肠道的神经递质,参与调节胃肠道运动和分泌功能。人体内90%的5-HT 存在于消化道黏膜,外周神经系统的5-HT 几乎全部由位于胃肠腺腔底部的肠嗜铬细胞产生贮存和再摄取[13]。研究表明5-HT 通过对胃肠动力、分泌和内脏敏感性等影响从而在FD发病机制中发挥作用[14]。本实验结果表明,广陈皮能够促进FD大鼠血清中5-HT分泌,其中新皮组和十年皮组5-HT含量高于模拟陈化组,说明不同陈化方法对5-HT的影响存在差异。5-HT通过作用于不同受体来调节胃肠道的运动,其中与胃肠道关系较为密切的兴奋性受体有5-HT4R等。5-HT4R受体属于G蛋白偶联受体,在脑和外周组织均有分布,在外周主要分布于胃肠道、膀胱和心脏,参与胃肠道平滑肌收缩,激活神经元细胞释放乙酰胆碱从而促进胃肠运动。本实验的蛋白免疫印迹法结果表明广陈皮可上调FD大鼠十二指肠5-HT4R蛋白表达,推测广陈皮可能是通过5-HT与十二指肠中的5-HT4R受体结合来增强肠动力。

广陈皮中主要含有黄酮类和挥发油类成分,其中黄酮类成分具有促消化、抗炎及抗氧化等药理作用[15-16];挥发油具有平喘、止咳、抗变应性炎症、抗氧化和抗菌的作用[17],是其主要的活性成分。本项目组前期研究和文献报道[7,18-19]均表明随着陈化时间的延长,主要黄酮类成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量均有增加,挥发油类成分的种类和相对含量均发生变化,酯、酸、醇类成分增加。黄酮类和挥发油类成分在陈化过程中量变和质变与药效的相关性仍需进一步研究。

综上所述,本研究结果表明,广陈皮可促进FD模型大鼠的胃肠动力,其作用机制可能与促进胃动素和5-HT的分泌及十二指肠中5-HT4R蛋白表达上调有关。新陈皮、10年陈皮和模拟陈化样品均可促进胃肠动力,陈化时间对FD大鼠的促胃肠动力作用影响不明显,初步确定模拟陈化方法可行。笔者在下一步实验中将优化广陈皮模拟陈化条件并全面比较模拟陈化与自然陈化样品的药效作用差异,为广陈皮人工模拟陈化提供更多科学依据。