我国弓形虫Chinese 1优势基因型感染对小鼠组织中微量金属元素代谢的影响

幸忆恩，蔡亦红

安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系，安徽医科大学病原生物学安徽省重点实验室，安徽医科大学人畜共患病安徽高校省级重点实验室，安徽 合肥 230032

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的原虫，感染全球超过30%的人口，相关疾病负担较高[1-2]。速殖子是弓形虫的快速增殖阶段，可通过血流播散并感染中枢神经系统、眼、骨骼、心肌、胎盘以及肝、肾等组织和器官[3-4]。弓形虫还可长期潜伏在脑、心脏和肌肉等人体组织中，以缓殖子的形式存在，当机体免疫力下降或环境刺激时会被再次激活，引发严重疾病，甚至致死[5]。弓形虫在全球普遍存在，不同地区基因型差异明显[6]，Chinese 1 型（ToxoDB#9）是我国弓形虫的优势基因型虫株，其中TgCtwh6为成囊株[7]。

微量金属元素，如铜、锌、铁、锰等，是维持细胞正常功能的重要元素，也是哺乳动物发育的关键调节剂[8-9]。本课题组前期研究发现，小鼠急性感染Chinese 1 型弓形虫TgCtwh3、TgCtwh6 会诱导体内各组织微量元素含量发生改变，说明虫体入侵会打破机体内微量元素稳态，进一步诱导宿主新陈代谢紊乱[10-11]。本研究主要通过构建我国流行的弓形虫优势基因型Chinese 1 型弱毒株（TgCtwh6）感染小鼠模型，分别在感染急性期和慢性期测定小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏中Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+等金属元素含量，并进一步探讨不同感染阶段金属元素含量的改变，以及对宿主功能代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验小鼠 6 周龄雌性C57BL/6J 小鼠，体重17～21 g，购于杭州子源实验动物科技有限公司（生产许可编号：SCXK2019-0004)。小鼠饲养条件：光照12 h/黑暗12 h 循环，相对湿度40%～60%，温度18～26 ℃，能随意获得食物。

1.2 弓形虫虫株 TgCtwh6 虫株（ToxoDB#9）为本实验室液氮保种，复苏后直接于昆明鼠腹腔内注射传代，经传2～3 代后用于正式实验。TgCtwh6株包囊鼠由本课题组传代保存，取TgCtwh6虫株保种小鼠脑组织，用5 mL PBS 通过200 目无菌滤网进行研磨匀浆，光镜下对包囊进行观察和计数，再以无菌PBS稀释匀浆。

1.3 主要试剂与仪器 硝酸（HNO3，优级纯，批号：220712）、30%双氧水（30%H2O2，分析纯，批号：221023）购自国药集团化学试剂有限公司；24 种多元素混合外标溶液（浓度：100 µg/mL，批号：220315）和7种多元素混合内标溶液（浓度：10µg/mL，批号：220517）购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；鼠源辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase, GAPDH）单抗（批号：1000292）购于武汉三鹰生物技术有限公司；兔源ZIP 8 单抗（批号：00045855）购于美国Proteintech 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性检测试剂盒（批号：202210）购于江苏酶免实业有限公司；涡旋混合器（型号：XW-80A）购自上海驰唐电子有限公司；分析天平购自METTLER TOLEDO 有限公司；纯水仪（型号：HK-UV-20）购自合肥宏科科技有限公司；36 孔石墨消解仪（型号：ST36-iTouch）购自Digi Block 公司；Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析仪（型号：Ⅰ型）购自北京毅新博创生物科技有限公司。

1.4 小鼠模型的建立 将18 只雌性C57BL/6J 小鼠在标准条件下适应性喂养1 周后，随机分为对照组、感染急性期组和感染慢性期组，每组6 只。对照组小鼠每只经口灌胃200 μL无菌生理盐水，1个月后颈椎脱臼处死，收集小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏；TgCtwh6 感染急性期组小鼠每只经口灌胃200 μL无菌生理盐水悬液（内含约20 个TgCtwh6 包囊），模型建立后每天观察小鼠状态，约1～2 周发现有竖毛、弓背、行动迟缓、畏光等现象时，颈椎脱臼处死，收集小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏；TgCtwh6感染慢性期组小鼠每只经口灌胃200 μL 无菌生理盐水悬液（内含约20 个TgCtwh6 包囊），感染1 个月后，颈椎脱臼处死，收集小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏。收集的所有脏器经液氮速冻后转移至-80 ℃保存。

1.5 小鼠组织内金属元素测定 取出-80 ℃保存的小鼠脏器，用超纯水清洗3 次，滤纸吸干表面水分，准确称取0.1 g 组织，分别转移至玻璃消解管，每个样品分3 次加入混酸溶液（HNO3与H2O2的体积比为2∶1），共3 mL。置于36 孔石墨消解仪加热消解，当组织消解完毕且消解管内溶液约为0.5 mL时取出消解管，待冷却后使用超纯水定容。用Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析仪测定并计算Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+含量，各元素含量（μg/g）=样品元素浓度（μg/mL）×样品定容体积（mL）/样品质量（g）。

1.6 ZIP 8（Zrt-and-Irt-like protein 8）蛋白表达测定用组织总蛋白提取试剂盒提取肝脏组织总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。采用Western blot 检测ZIP 8 蛋白表达，将三组小鼠的肝脏蛋白样本进行SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白后转印到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜3 次（10 min/次）后，使用ZIP 8 单抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，同上洗涤后，将膜转至1∶10 000稀释的羊抗鼠二抗中室温孵育1.5 h，最终用凝胶成像仪成像。

1.7 SOD 活性测定 称取0.1 g 小鼠肝脏组织，加入0.9 mL的PBS，充分匀浆，1 000×g离心20 min，收集上清。按照超氧化物歧化酶活性试剂盒说明书采用分光光度法测定肝脏SOD活性。

1.8 图像与数据分析 使用Image J 1.8.0 软件对Western blot 结果进行分析。使用GraphPad Prism 6.02 软件进行数据统计分析，多组间均数采用方差分析，若差异有统计学意义，采用Bonferroni 法进行两两比较，检验水准α=0.05。

1.9 伦理学声明 所有程序严格遵循安徽医科大学动物中心生物医学研究所机构审查委员会制定的伦理标准（许可证号：AMU26-081108）。

2 结 果

2.1 TgCtwh6 感染小鼠模型的构建 TgCtwh6 感染小鼠发病后，将其颈椎脱臼处死，无菌状态下取小鼠腹水，取10 μL 腹水在载玻片上制片，显微镜下可观察到TgCtwh6速殖子，说明急性期感染模型构建成功（图1A）；TgCtwh6 感染小鼠1 个月后，在小鼠脑组织匀浆中可观察到包囊的形成，说明慢性期感染模型构建成功（图1B）。

图1 TgCtwh6感染小鼠模型的构建Figure 1 Construction of TgCtwh6 infected mice model

2.2 TgCtwh6感染小鼠不同组织金属元素含量

2.2.1 Fe2+含量 三组小鼠肝脏、脾脏和肾脏内Fe2+含量组间差异均有统计学意义（F=21.420、6.881、5.196，P均＜0.05）。急性期组和慢性期组肝脏内Fe2+含量分别为（76.348±11.613）μg/g 和（88.545±10.555）μg/g，高于对照组的（52.388±6.165）μg/g；急性期组和慢性期组脾脏内Fe2+含量分别为（128.519±13.531）μg/g 和（120.309±10.023）μg/g，低于对照组的（147.720±15.303）μg/g；急性期组肾脏内Fe2+含量为（39.918±3.120）μg/g，低于慢性期组的（46.352±4.816）μg/g，差异均有统计学意义（P均＜0.017）。心脏内Fe2+含量组间差异无统计学意义（F=1.293，P＞0.05）。见图2A。

2.2.2 Cu2+含量 三组小鼠心脏内Cu2+含量组间差异有统计学意义（F=8.558，P＜0.05），急性期组和慢性期组分别为（5.189±0.255）μg/g和（5.631±0.485）μg/g，低于对照组的（6.440±0.740）μg/g，差异均有统计学意义（P均＜0.017）。肝脏、脾脏和肾脏组间差异均无统计学意义（F=2.805、1.367、1.993，P均＞0.05）。见图2B。

2.2.3 Mn2+含量 三组小鼠心脏和肝脏内Mn2+含量组间差异均有统计学意义（F=3.977、23.180，P均＜0.05）。急性期组小鼠心脏内Mn2+含量为（0.605±0.052）μg/g，低于对照组的（0.686±0.051）μg/g；急性期组和慢性期组肝脏内Mn2+含量为（1.298±0.065）μg/g 和（1.405±0.066）μg/g，高于对照组的（1.141±0.110）μg/g，差异均有统计学意义（P均＜0.017）。脾脏和肾脏组间差异均无统计学意义（F=0.535、3.332，P均＞0.05）。见图2C。

2.2.4 Zn2+含量 三组小鼠心脏和肝脏内Zn2+含量组间差异有统计学意义（F=11.550、8.125，P均＜0.05）。急性期组和慢性期组小鼠心脏内Zn2+含量分别为（17.034±0.974）μg/g和（16.858±0.953）μg/g，低于对照组的（19.258±0.965）μg/g；急性期组和慢性期组小鼠肝脏内Zn2+含量分别为（17.506±0.824）μg/g和（17.031±0.907）μg/g，高于对照组的（15.650±0.305）μg/g，差异均有统计学意义（P＜0.017）。脾脏和肾脏组间差异无统计学意义（F=0.878、0.013，P均＞0.05）。见图2D。

2.2.5 Mg2+含量 三组小鼠心脏内Mg2+含量组间差异有统计学意义（F=4.084，P＜0.05），急性期组为（153.346±3.221）μ g/g，低于对照组的（163.012±8.204）μg/g，差异有统计学意义（P＜0.017）；肝脏、脾脏和肾脏组间差异均无统计学意义（F=1.612、0.247、2.380，P均＞0.05）。见图2E。

2.3 TgCtwh6 感染小鼠肝脏组织中ZIP 8 蛋白表达 Western blot 结果表明，对照组、急性期组和慢性期组小鼠肝脏ZIP 8相对表达量组间差异有统计学意义（F=35.240，P＜0.05）。急性期组和慢性期组均高于对照组，且慢性期组高于急性期组，差异均有统计学意义（P均＜0.017）。见图3。

图3 肝脏中ZIP 8蛋白相对表达量差异Figure 3 Difference of ZIP 8 relatively expressed in the liver

2.4 TgCtwh6感染小鼠肝脏组织中SOD 活性 对照组、急性期组和慢性期组小鼠肝脏SOD 活性分别为（14.041±0.734）U/mL、（16.463±0.616）U/mL和（15.859±0.780）U/mL，组间差异有统计学意义（F=9.370，P＜0.05），急性期组和慢性期组均高于对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.017）。

3 讨 论

在弓形虫急性感染期，快速生长的速殖子通过血流播散并感染如中枢神经、眼睛、骨骼、心脏以及胎盘等多处组织，可引起强烈的炎症反应并造成组织破坏，从而引发相应的临床表现。急性发病期后，虫体可长期潜伏在宿主体内形成缓殖子，缓殖子被厚厚的包囊壁包围，在脑、心脏和骨骼肌中持续存在，并且缓殖子还可从包囊中被释放出来，发育增殖为速殖子，引起眼病、脑病等[12]。本研究通过构建弓形虫感染急性和慢性期小鼠模型，观察不同组织中微量金属元素留存情况，进一步探索弓形虫不同感染状态下，宿主代谢功能的改变，为研究弓形虫病的发病机制提供线索。

生物金属元素是几乎所有细胞生长过程中蛋白质的辅助因子，在寄生虫和宿主细胞的代谢中都扮演着十分重要的角色，生物金属元素的摄取、流失及转运与疾病进展密切相关[10]。铁元素与免疫细胞功能相关，当机体受感染时，巨噬细胞中输出铁元素可激发机体抗菌潜力[13]。锌元素参与细胞凋亡的调节，具有抗氧化和抗炎作用[14]。本研究发现，在弓形虫感染急性和慢性期，小鼠不同组织中各微量金属元素均发生了不同水平的改变。通过对急性和慢性期金属元素含量进行分析，发现相较于对照组，感染急性和慢性期小鼠肝脏中锰元素均上调，且慢性期锰元素上调更明显。锰元素是细胞活动的必需微量元素，在物质代谢中起着重要作用，锰元素缺乏会增加细胞对氧化损伤的敏感性，导致细胞产生SOD 的能力下降，促进细胞损伤[15]。最新研究表明，缺乏锰元素的小鼠体内肿瘤细胞生长加快，外源性添加锰元素则可有效激活人或小鼠抗原递呈细胞的cGAS-STING 通路，增强NK 细胞的免疫监视作用，促进细胞毒性T 细胞的浸润和肿瘤特异性杀伤功能[16]。弓形虫慢性感染后小鼠肝组织内锰元素含量上调是否是机体在抵抗寄生虫感染过程中启动免疫细胞功能的自我保护策略，有待进一步研究。

细胞摄取微量金属元素必须通过相应的转运体进行运输，如ZIP 家族[17]。ZIP 8 是ZIP 家族金属转运蛋白的成员之一，可转运锌、锰和铁等[18]。ZIP 8 在宿主防御病原体感染中发挥作用，有研究表明ZIP 8 的缺失会导致感染肺炎链球菌的小鼠炎症反应增加、组织损伤加重[19]。前期研究已证明弓形虫Chinese 1 型另一虫株TgCtwh3 感染急性期小鼠肝细胞膜上的ZIP 8可通过转运锌对肝脏起保护性作用[11]。本研究中也发现小鼠肝脏中ZIP 8 的表达在弓形虫TgCtwh6感染急性和慢性期均上调，且慢性感染期上调更为显著。同时，本研究发现在弓形虫感染后小鼠肝脏中通过ZIP 8 转运的锌、铁等其他元素含量也有所上调，这与ZIP 8 表达上调的结果一致。

SOD 是有氧代谢系统中的抗氧化物酶之一，根据活性中心所含金属离子的不同，分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD 三种，前两者可存在于真核细胞生物，后者存在于原核生物中[20]。本研究发现急性和慢性感染期小鼠肝脏SOD 活性均上调，可能由于感染小鼠肝脏内ZIP 8 表达上调，导致多种金属含量增加，使得Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性被激活。虽然锰元素的含量在感染慢性期上调更为明显，但是急性期和慢性期SOD 活性差异无统计学意义，可能由于Cu/Zn-SOD 主要存在于胞浆内，而Mn-SOD 则存在于线粒体中。有待进一步检测急性和慢性感染期线粒体中Mn-SOD 的活性差异，从而探索不同感染状态下的致病机制。

综上，我国弓形虫优势基因型Chinese 1 弱毒株（TgCtwh6）感染小鼠在急性和慢性感染期肝组织内ZIP 8 表达上调，多种金属元素含量受调节，SOD 活性被激活。本研究从体内微量元素代谢的角度，初步探索了虫体与宿主之间的相互关系，为进一步研究弓形虫的致病机制提供了新的方向。

利益冲突声明全部作者声明无利益冲突

作者贡献声明幸忆恩负责研究实施及论文撰写；蔡亦红负责研究设计和论文撰写指导