2016—2020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

冯明子，傅荔艳，葛盈露，马婉婉，王鹏，孙永，史永林,

1.安徽医科大学公共卫生学院，安徽 合肥 230032；2.安徽省疾病预防控制中心，安徽省公共卫生研究院，安徽省医疗卫生重点专科病原微生物分子生物学实验室

柯萨奇病毒A 组16 型（coxsackievirus A16,CV-A16）是小RNA 病毒科肠道病毒属的一种，为单正链RNA 病毒，基因组全长约7.4 kb，是引发手足口病（hand, foot and mouth disease, HFMD）的常见病原体之一，于1951 年首次被分离出[1]。按照CV-A16 基因组VP1 区基因序列可将其分为A、B和D 三个基因型，A 基因型的唯一成员是G-10 原型株；而B 基因型分为B1、B2 亚型，B1 亚型进一步分为B1a、B1b 和B1c；D 基因型为新发现型别，比较少见[2-3]。近年来安徽省HFMD 发病水平一直较高，而对HFMD 相关病原学的分子分型研究相对较少[4-5]。本研究收集安徽省各地的HFMD CV-A16核酸阳性咽拭子标本，利用生物信息学和分子遗传学方法鉴定病毒基因型，并对其VP1区测定的序列进行遗传进化和氨基酸变异位点分析，为进一步研究疾病分子机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 资料与标本来源 本研究中安徽省2016 年1月—2020 年12 月HFMD 病例信息来源于中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统。收集安徽省各市（县、区）2016 年1 月—2020 年12 月HFMD患者CV-A16核酸阳性咽拭子样本。病例标本采集与实验室检测符合《手足口病预防控制指南（2009版）》[6]要求。

1.2 主要试剂与仪器 核酸提取试剂盒（665A，中国台湾圆点公司）；磁珠法自动核酸提取仪（SLA-32，中国台湾圆点公司）；荧光定量PCR 扩增仪（Quant-Studio 5,Thermo Fisher）；普通PCR 扩增仪（Mastercycler X50P,Eppendorf）；肠道病毒CV-A16荧光定量PCR检测试剂盒（P531，西安天隆公司）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver 2.0（RR055A,Takara）。

1.3 核酸抽提与荧光定量PCR 和RT-PCR 取出保存的咽拭子标本在室温条件下融化，漩涡振荡混匀后在二级生物安全柜内取200 μL 混匀液抽提病毒RNA，提取步骤按照核酸提取仪操作说明书进行，程序运行完成后吸取核酸洗脱液置-20 ℃备用。采用肠道病毒CV-A16 荧光定量PCR 检测试剂盒对收集到的HFMD 核酸阳性标本进行检测，对检出的CV-A16 阳性标本VP1 区基因序列进行RT-PCR 扩增。CV-A16 VP1 区基因RT-PCR 扩增引物（CV-A16-VP1-S/ CV-A16-VP1-A）参照文献[7]，RT-PCR 扩增体系25 μL，反应条件：逆转录50 ℃30 min，1 个循环；预变性95 ℃15 min，1 个循环；三步循环94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，40个循环；总延伸72 ℃10 min。PCR 扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离特异性目的条带。

1.4 基因序列测定与进化分析 将扩增出的阳性PCR 产物送到上海伯杰医疗科技股份有限公司测序，测序结果提交到肠道病毒在线分型网站（https://www.rivm.nl/mpf/typing tool/enterovirus/）进行CVA16 基因型别分析，并同步提交到NCBI 网站进行BLAST 比对。从GenBank 数据库下载CV-A16 各基因型参考序列，在MEGA 6.0 生物软件中采用Clustal W 法进行基因序列比对，采用邻接法（neighbor-joining, NJ）构建CV-A16 VP1 区基因系统进化树。肠道病毒参考株VP1 区序列分别为U05876、 EU812514、 AM292468、 AM292455、LT577709、 AM292476、 JN248420、 KU596021、KX871389、KX586352、MW197387、MW999272、MW999274、MT553210、MT553192、MT553208、MW197395、LC603085、MT119437、MT553222、MT663414、MZ043547、MZ491035、KM260139、KU595992、KX871449、MH003973、MT119428、MW197293、MW197351、MW462142、KC866888、KP341916。

2 结 果

2.1 HFMD 流行概况 2016—2020 年安徽省累计报告HFMD 实验室确诊病例16 650 例，各年依次为1 057 例、2 955 例、4 202 例、3 962 例、4 474例。肠道病毒A 组71 型（enterovirus A71,EV-A71）共1 296 份（占7.78%）；CV-A16 型共3 809 份（占22.88%）；其他型别共11 545 份（占69.34%）。2016—2020 年CV-A16 在实验室确诊病例中的构成比依次为20.72%（219/1 057）、22.91%（677/2 955）、23.89%（1 004/4 202）、42.58%（1 687/3 962）、4.96%（222/4 474）。见图1。

图1 2016—2020年安徽省HFMD实验室确诊病例和CV-A16病例分布情况Figure 1 Monthly reported HFMD cases confirmed via laboratory studies and the proportion of CV-A16 cases in Anhui Province from 2016 to 2020

2.2 测序与基因型别鉴定 共有436 份CV-A16核酸阳性样本纳入研究。经测序后进行比对和同源性分析获得290 条阳性序列，均为B1 亚型，其中B1a 基因亚型65 株，占22.41%（65/290），B1b 基因亚型225株，占77.59%（225/290）。见表1。

表1 2016—2020年安徽省HFMD CV-A16基因型分布情况Table 1 Distribution of HFMD CV-A16 genotypes in Anhui Province from 2016 to 2020

2.3 同源性比较与进化分析 290 条CV-A16 VP1基因序列核苷酸碱基均为891 个，编码297 个氨基酸，未见缺失或插入序列；其核苷酸和氨基酸序列同源性为86.80%～100.00%和97.60%～100.00%，与CV-A16原型株（G-10,U05876）核苷酸和氨基酸序列同源性为74.10%～76.80%和90.50%～92.20%；65 条B1a 型VP1 区基因序列与GenBank 数据库中B1a 参考株（KC866888）核苷酸和氨基酸序列同源性为93.00%～99.90%和98.60%～100.00%，225 条B1b 型VP1 区基因序列与GenBank 数据库中B1b参考株（KP341916）核苷酸和氨基酸序列同源性为88.40%～99.60%和98.60%～100.00%。

CV-A16 VP1 基因序列亲缘性进化树分析表明，2016—2020 年安徽省CV-A16 流行毒株属于B基因型B1a 和B1b 基因亚型，未鉴定出其他基因型。进一步分析显示，CV-A16 B1a 基因亚型流行株在遗传进化上大致分为Cluster A、Cluster B、Cluster C 和Cluster D 分支簇。见图2。2017 年阜阳市、2020 年淮南市和合肥市部分B1a 流行株属于Cluster A 进化分支；2019 年合肥市、宣城市、黄山市、蚌埠市和淮北市B1a 流行株属于Cluster B 进化分支；2018 年和2020 年合肥市部分B1a 流行株属于Cluster C进化分支；2016 年安庆市B1a流行株属于Cluster D 进化分支。Cluster D 分支簇流行株与福建株（KU596021）、山东烟台株（KX586352）、上海株（KX871389）亲缘性关系较近。

图2 2016—2020年安徽省CV-A16 VP1区基因进化树Figure 2 Phylogenetic tree of VP1 gene sequences of CVA16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020

2016—2020年鉴定出的CV-A16 B1b基因亚型流行株在遗传进化上大致分为6 个分支簇（ClusterⅠ～Ⅵ），见图2。2016 年阜阳市、合肥市，2017 年宣城市、安庆市、滁州市，2018 年蚌埠市、铜陵市，2019 年合肥市、宣城市的B1b 流行株属于ClusterⅠ进化分支；2017 年淮北市和阜阳市，2018 年合肥市和蚌埠市B1b 流行株属于Cluster Ⅱ进化分支；2016 年安庆市和阜阳市B1b 流行株属于Cluster Ⅲ进化分支；2016 年合肥市和阜阳市，2017 年合肥市、宣城市、安庆市和滁州市，2018 年铜陵市，2019年宣城市和铜陵市部分流行株属于Cluster Ⅳ进化分支；2016 年阜阳市、安庆市，2017 年滁州市、阜阳市、合肥市和2019 年合肥市部分流行株属于Cluster Ⅴ进化分支；2016 年安庆市、2017 年合肥市、2018年铜陵市部分流行株属于Cluster Ⅵ进化分支。

2.4 VP1 区氨基酸变异位点分布情况 2016—2020 年CV-A16 型VP1 基因序列与CV-A16 原型株（G-10, U05876）进行氨基酸变异情况分析发现，290 条序列VP1 区297 个氨基酸编码位点中有20个发生变异，见表2。2016 年安徽省检出的60 株CV-A16 B1a 和B1b 流行株VP1 区有21 个氨基酸编码位点发生变异，比表2 中多了1 个变异位点（VP1-A11T）；2018 年和2019 年共检出的147 株B1a 和B1b CV-A16 流行株，VP1 区有21 个氨基酸编码位点发生变异，比表2 中多了1 个变异位点（VP1-P215L）。本研究发现2016—2020 年安徽省225株B1b CV-A16毒株中有181株VP1区第14个氨基酸编码位点出现变异（S14N），占80.44%（181/225）;205 株VP1 区第23 个氨基酸编码位点出现变异（L23M），占91.11%（205/225），在B1a CV-A16 毒株中未见变异。

表2 2016—2020年安徽省CV-A16 VP1区氨基酸位点变异情况Table 2 Amino acid site variation in VP1 region of CV-A16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020

3 讨 论

HFMD 的主要表现是患者手、足和口腔皮肤或黏膜皮损，前驱症状多为发烧、上呼吸道不适[8]。1981 年上海报告我国首例HFMD 病例，此后至2007 年HFMD 在我国的流行表现为局部地区小规模暴发，重症和死亡病例少见；2007 年后HFMD 局部地区出现较大规模暴发，重症和死亡病例数呈升高趋势[9]。2008—2017 年安徽省共报告HFMD 病例930 613 例，其中重症病例4 738 例，在全国排名第11 位；死亡病例147 例，在全国排名第9 位[5,10]。有研究表明，2017—2018年安徽省HFMD CV-A6实验室确诊病例数较以往有升高趋势，且病原谱发生变化，可能与EV-A71灭活疫苗的接种数量有关[11]。

既往研究表明，1999—2008 年我国流行的CVA16 毒株都属于B1a 和B1b 基因亚型，在2008 年之后出现B1c 基因亚型，但B1b 基因亚型始终处于优势地位[12-14]。B1a 分支毒株最早于1995 年在日本被发现，随后在我国、马来西亚和泰国成为CV-A16主要流行株[15]。近年来，CV-A16 B1 基因亚型成为我国主要流行株，也是安徽省的优势流行株，以CV-A16 B1b 分支为优势基因型，B1a 分支与其共同流行及进化循环[7,16]。本研究结果显示，2016—2020年安徽省B1b基因亚型分支成为优势流行株，这与安徽省先前有关CV-A16 毒株分子遗传进化分析的情况基本一致[7,16]。

对2016—2020 年安徽省CV-A16 流行株序列基因型别的占比进行分析发现，2016—2018 年CVA16 B1b 基因亚型占比均超过90%；而2019 年CVA16 B1a 基因亚型毒株所占比例与同年CV-A16 B1b 比例接近；2020 年CV-A16 B1a 基因亚型毒株所占比例明显高于CV-A16 B1b，占比近90%。这可能提示安徽省HFMD CV-A16 流行株基因亚型有改变的趋势，待后续的监测数据证实。从进化树聚类结果看，安徽省CV-A16 B1a Cluster D 分支簇流行株与部分周边城市亲缘关系较近，提示安徽省HFMD CV-A16 B1a 流行株在演变过程中可能与周边区域流行株共同循环和进化。此外，安徽省290株CV-A16 毒株VP1 区氨基酸序列变异分析发现，5 年中290 株CV-A16 序列中有288 株病毒在VP1区13 位上由苏氨酸替换为天冬酰胺，但2019 年的2 株B1b 基因亚型毒株（19BB002- 2019013b、19BB004-2019015b）在13 位上由苏氨酸替换为丝氨酸，是否提示安徽省CV-A16 B1b 基因亚型在循环进化中演变成新的分支有待后续研究证实。

本研究证实了HFMD CV-A16 肠道病毒B1a 和B1b 两种基因亚型在安徽省共同存在，且B1 毒株流行的优势基因型别发生了变化，为完善安徽省手足口病病原谱分子进化资料以及疾病防控提供了科学参考。但本研究收集到的手足口病患儿咽拭子样本均来自轻症病例，无重症病例标本，且2020年受新冠病毒感染疫情影响收集到的标本数量较少，可能会导致本研究结果存在一定局限性。

利益冲突声明全部作者声明无利益冲突

作者贡献声明冯明子负责样本收集与整理、实验室检测、论文撰写；傅荔艳、葛盈露、王鹏参与实验室检测；马婉婉负责数据整理和分析；孙永、史永林负责研究设计、论文撰写指导