广西产不同品种石韦的高效液相指纹图谱研究

崔露露 池雨锋 张锐利 马继永 高德民

【摘 要】 目的：建立广西产不同品种石韦药材的HPLC指纹图谱，对其进行分析和质量评价，同时测定石韦中绿原酸、芒果苷、山奈素、芦丁的含量。方法：采用HPLC测定广西产6批不同品种石韦药材的含量， 分别运用SPSS 19.0软件和中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版对广西产6批不同品种石韦药材的14个共有峰进行聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和相似度分析。结果：广西产不同品种石韦中绿原酸含量最高，其次为芦丁、芒果苷和山奈素。其中，有柄石韦中绿原酸最高，石韦中芒果苷最高，而在柔软石韦中芦丁及山奈素含量较高。对其指纹图谱进行比较，聚类分析中除绒毛石韦外，其它石韦可为一类；主成分分析中越石韦、庐山石韦、有柄石韦和柔软石韦为一类；在相似度分析中，对比药典项下石韦，可见中越石韦与庐山石韦、有柄石韦较接近。结论：广西产不同品种石韦中绿原酸，芒果苷，山奈素，芦丁含量存在差异。此外，相似度分析，主成分分析和聚类分析结果为鉴别石韦药材提供依据，为石韦药材质量标准的完善和临床用药提供参考。

【关键词】 石韦；高效液相色谱法；相似度分析；聚类分析；主成分分析

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）15-0050-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202315012

Abstract：Objective The HPLC Fingerprints were built to analyze and evaluate the different Pyrrosia from Guangxi province. Simultaneously， the contents of chlorogenic acid， mangiferin， kaempferol and rutin were determined.Methods 14 peaks of the common model were collected and used by establishing HPLC fingerprint from Guangxi Pyrrosia species The data were applied to professional software named SPSS 19.0 statistical analysis software for hierarchical cluster analysis （HCA） and principal component analysis （PCA） and Similarity Evaluation System for chromatographic fingerprint of TCMs （Version 2004 A） recommended by the SFDA of China for evaluating similarities.Results The content of four ingredients were determined， which it were chlorogenic acid> rutin > mangiferin> kaempferol. Among them， chlorogenic acid and mangiferin were the highest in P. petiolosa and P. lingua respectively， while the contents of rutin and kaempferol were higher in P. mollis. To compare their fingerprints， except for P. subfurfuracea， the others can be classified as one class by HCA. The PCA method showed that it was categorized into one group： P. tonkinensis，P. sheareri，P. petiolosa and P. mollis. And the similarity values， P. tonkinensis，P. sheareri， and P. petiolosa， were very close by comparing the pharmacopeia. Conclusions The content of main ingredients （chlorogenic acid， mangiferin， kaempferol and rutin） was difference from different species Pyrrosia. Besides，it provides a basis for identifying and evaluating the quality of Pyrrosia by the similarity analysis，PCA and HCA， and offers a reference for the quality standards and clinical application of Pyrrosia.

Keywords：Pyrrosia; HPLC; Similarity Analysis; HCA; PCA

石韋为水龙骨科（Polypodiaceae）石韦属（Pyrrosia）的多种植物的干燥叶，主要分布于华北、西北及湖南等地区。2020年版《中华人民共和国药典》将同属植物石韦［Pyrrosia lingua（Thunb.） Fat-well］、有柄石韦［Pyrrosia petiolosa（Christ） Ching］和庐山石韦［Pyrrosia sheareri（Bak.） Ching］的干燥叶作为石韦药材来源。石韦具有利尿通淋、清肺止咳、凉血止血的功效，临床用于治疗热淋、血淋、石淋、肺热喘咳、吐血、衄血等症。现代研究［1］表明石韦含有黄酮、酚酸及皂苷类成分，如绿原酸、芒果苷、山奈素、芦丁、咖啡酸、胡萝卜苷等。绿原酸具有抗菌解毒、消炎利胆和抗脂质过氧化等作用［2-4］；芒果苷具有良好的抗炎、抗病毒和保肝等作用［5-7］；山奈素具有抗癌、抗感染及抗炎作用［8-10］；芦丁具有抗自由基、抗病毒及抗肿瘤等作用［11-13］。

石韦作为药材应用，首载于《神农本草经》，此后历代本草著作多有记载。目前有部分地区以非药典品种入药，尤其是在广西省，柔软石韦［Pyrrosia mollis（Kunze）Ching］常见于药材市场［14］。本研究在广西药材市场收集了多份广西产石韦药材样本，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定，除药典品种外，还有中越石韦［Pyrrosia tonkinensis（Gies.） Ching］、有柄石韦［Pyrrosia petiolosa（Christ） Ching］（A005）及柔软石韦［Pyrrosia mollis （Kunze） Ching］。为比较广西产不同品种石韦之间的差异，本次实验采用高效液相法建立石韦的指纹图谱，并测定石韦中绿原酸、芒果苷、山奈素及芦丁的含量，同时进行相似度分析，主成分分析和聚类分析［15-19］，用以比较广西产不同品种石韦的质量差异。为石韦质量控制和临床用药提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦高效液相色谱仪（型号1100，DAD 检测器）；分析天平（上海菁海仪器有限公司）；KQ-100DE超声波清洗器（医用超声波清洗器）；SHZ-DⅢ真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 试药 中国食品药品检定研究院绿原酸标准品（批号：110753-202018）；山奈素标准品（批号：110861-202013）；芦丁对照品（批号：100080-201811）；芒果苷对照品（批号：111607-201704）。乙腈为色谱纯，磷酸、甲醇为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材 购买的药材样品，产地为广西省，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定，分别为石韦［Pyrrosia lingua（Thunb.） Fat-well］（A001广西桂林）、绒毛石韦［Pyrrosia subfurfuracea（Hook.） Ching］（A002广西玉林）、中越石韦［Pyrrosia tonkinensis（Gies.） Ching］（A003广西河池）、庐山石韦［Pyrrosia sheareri（Bak.） Ching］（A004广西玉林）、有柄石韦［Pyrrosia petiolosa（Christ） Ching］（A005广西河池）及柔软石韦［Pyrrosia mollis（Kunze） Ching］（A006广西茂名）。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 采用Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；进样量20 μL，流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，洗脱程序（0～15 min，10% A；15～35 min，10%～15% A；35～60 min，15%～23% A；60～70 min，23% A），检测波长300 nm。

2.2 对照液的制备 分别精密称取绿原酸、芒果苷、山奈素、芦丁对照品25.00 mg、1.00 mg、0.75 mg、2.00 mg，置于4个10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，作为对照品储备液。然后分别精密吸取上述4种储备液各2 mL置于同一10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，作为混合对照品溶液（每1 mL混合对照品溶液含绿原酸500.0 μg、芒果苷20.0 μg、山奈素15.0 μg、芦丁 40.0 μg）。

2.3 供试液的制备 取药材粉末1.0 g，精密称定，置50 mL碘量瓶中，移取50%甲醇15 mL加入，盖塞称重，超声提取40 min，冷至室温后，再次称重，用50%甲醇补足失重，摇匀，过滤得提取液，二次提取用50%甲醇15 mL，重复上述操作，提取20 min，合并两次提取液，过 0.45 μm 微孔滤膜，即得供试液。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL置于2 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，测定线性关系，以浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。见表1。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取2.3项下的供试品，连续进样6次，以3号特征峰为基准，计算色谱图各特征峰的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）的RSD，分别为0.33%～4.92%和0.69%～4.75%，表明该仪器的精密度良好。结果见表2。

2.5.2 稳定性考察 取有柄石韦（A005）药材，按前述方法制备供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，计算各特征峰RRT和RPA的RSD，结果均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。结果见表2。

2.5.3 重复性考察 取石韦（A001）样品6份，按前述方法制备6份供试液进行测定，得到4种成分含量，计算其RSD值，四种成分RSD值均在5%以内，表明本方法的重复性好。结果见表3。

2.5.4 加样回收率考察 精密称定已知含量的石韦（A001）药材，取与药材含量接近的对照品储备液，加入药材中，按前述方法制备供试品溶液，进行测定，测得加样回收率均在95%～105%之间。结果见表4。

2.6 石韦指纹图谱的建立 本实验选取6种石韦样品，按前述方法制备供试液进行测定。依据各峰的RRT和RPA挑選14个特征峰，如图1所示，由于品种不同，仅对药典项下石韦（A001）、庐山石韦（A004）、有柄石韦（A005）三种样品建立共有模式指纹图谱，如图2所示，经与对照指纹图谱（如图3所示）对照，确定峰5为绿原酸，峰8为芒果苷，峰11为山奈素，峰12为芦丁。

2.6.1 样品含量测定 分别取6种石韦样品，依据前述方法制备供试液进行测定，用外标法计算4种成分的含量。结果见表5。

如表5显示，所有的样品中绿原酸含量较高，其次为芦丁、芒果苷和山奈酚；其中有柄石韦绿原酸含量最高，中越石韦与有柄石韦不含山奈素（或含量极低）；石韦中芒果苷含量最高，绒毛石韦居其次；而在柔软石韦中芦丁及山奈素含量较高。

2.6.2 聚类分析 聚类分析可根据物质所含化学成分用数据统计软件对其进行分类或描述，并将一些观察对象依据某些特征加以归类，是研究事物分类的有效方法［20-21］。可依据所测样品的数据，对样品进行分类。本实验以同一产地不同品种的6种石韦为研究对象，进行指纹图谱研究，获得包括绿原酸、芒果苷、山奈素、芦丁在内的14个峰。系统聚类分析利用SPSS 19.0分析软件，使用欧氏平方距离作为样品的测度［22］，6种石韦样品基本可以分为2大类（如图4所示），石韦（A001）、 中越石韦（A003）、庐山石韦（A004）、有柄石韦（A005）和柔软石韦（A006）为第1类，绒毛石韦（A002）为第2类。

2.6.3 主成分分析 主成分分析是利用降低空间维度，对样品成分进行分类和分析的方法［23］。以6批样品中共有峰的14个峰面积为数据，利用SPSS 19.0进行主成分分析，以着重分析同一产地不同品种样品6批石韦样品之间成分的差异（如图5所示）。由结果可以看出，中越石韦（A003）、庐山石韦（A004）、有柄石韦（A005）和柔软石韦（A006）分布较为接近，基本为一类。石韦（A001）和绒毛石韦（A002）与其它石韦样品距离较远，成分差异性较大，可归为一类。

2.6.4 相似度评价 相似度评价系统可以对药材进行更全面的化学成分的分析和评价。本次实验 将6批药材样品的液相指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行相似度评价，根据多点校正法对样品色谱峰进行自动匹配，然后设定标准模板（图2）［24］，利用相关系数法对不同品种谱峰差异性和整体相似性进行评价，得各石韦相似度评价结果。石韦（A001）：0.5982；绒毛石韦（A002）：0.1844；中越石韦（A003）：0.6541；庐山石韦（A004）：0.7926；有柄石韦（A005）：0.9322；柔软石韦（A006）：0.4973。从分析结果可以看出，药典项下3种石韦由于品种的差异，其相似度值也存在差异；而除药典项下外，只有A003中越石韦相似度较高，与庐山石韦、有柄石韦较接近；其它3种石韦相似度均较低。这更符合聚类分析的结果， 将A003、A004和A005分为一组，同时此结果也符合主成分分析。

3 分析与讨论

化学指纹图谱强调的是色谱的完整性，通过指标性成分的定量分析，可以在一定程度上反映中药的质量。实验建立的石韦指纹图谱有良好稳定性及重现性，3种评价方法相辅相成，从不同方面对石韦的化学成分进行分析。有柄石韦中绿原酸含量远高于其它品种，石韦中的芒果苷含量较其它品种高，而柔软石韦中的芦丁和山奈素的含量均高于其它石韦，可以考虑依据成分的不同对其进行利用，扩大石韦的临床药用价值。

综上所述，来源于广西省不同地市的不同种石韦，化学成分有较大的差异，对于药典项下的三种石韦而言，有效成分绿原酸含量差异也较大，相似度也存在很大差异，而中越石韦与药典项下有柄石韦、庐山石韦比较接近，由聚类分析和主成分分析可以看出有柄石韦、庐山石韦和中越石韦较为接近。本次实验研究的药材批次較少，缺乏统计学意义，但是，也在一定程度上反映了不同品种石韦之间的差距。因此，以上分析结果可以为石韦药材的鉴定及质量评价提供依据，亦可依据其化学成分含量的差异对不同品种的石韦进行利用，从而扩大石韦的使用范围。

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［24］崔露露.石韋的HPLC指纹图谱研究与灰色关联度分析［D］.济南：山东中医药大学，2017.

（收稿日期：2022-11-30 编辑：陶希睿）

基金项目：2021年度山东省中医药科技项目（编号2021Q116）。

作者简介：崔露露（1989—）女，汉族，硕士，药品技术工程师，研究方向为中药及中成药质量控制。E-mail：cll5052@163.com

通信作者：高德民（1973—）男，汉族，博士，副教授，研究方向为中药资源研究与中药质量控制。E-mail： gdm607@126.com