自拟调气汤灌胃对顺铂诱导大鼠肾损伤的修复作用及其机制

阿依古丽·买合木提，古扎力努尔·艾尔肯，加依娜提·热马赞

1 新疆医科大第一附属医院药学部，乌鲁木齐 830054；2 新疆医科大学中心实验室

顺铂是一种广谱抗肿瘤药物，在肺癌及胃癌等消化道肿瘤的治疗中广泛应用，但因有肾毒性临床应用受到限制［1］。由顺铂引起的肾毒性通常表现出少尿、蛋白尿及肾小球滤过率降低等主要临床特征，严重影响患者生存质量。以往临床中对于顺铂引起的肾损伤主要采用甘露醇、氨磷汀等药物治疗，但存在有效率低，患者依从性差，同时易引起电解质紊乱等不良反应，因此对于顺铂诱导的肾损伤治疗药物的研发已成为当前工作重点。调气汤是本课题组以中医理论为指导自拟的一种中药方剂，由党参、白术、大黄等药材组成，具有健脾益气、燥湿利水、活血行气的功效。2022年6—12月，我们观察了自拟调气汤对顺铂诱导大鼠肾损伤的修复作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 大鼠90 只，雄性，健康清洁级，8 周龄，体质量（200 ± 20）g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（新）2018-0002。大鼠饲养于动物房，光照12 h/d，自由饮食，温度22～25 ℃，湿度40%～70%。

1.2 主要药品及试剂、仪器 自拟调气汤（党参20 g，白茅根、土茯苓各30 g，白术、茯苓、莱菔子、鸡内金、佩兰、丹参、川芎、川牛膝各15 g，陈皮、酒大黄、砂仁、清半夏各10 g，紫苏叶、黄连各12 g），将药材饮片浸泡至3 000 mL 蒸馏水中4 h，沸水煎煮1 h，过滤，留取滤液，将药材残渣置于1 500 mL 水中再次煎煮1 h，过滤，取滤液，合并两次滤液后，蒸发浓缩，制成每毫升含5 g 生药的制剂（北京同仁堂药业）；顺铂注射液（江苏豪森药业，规格6 mL︰30 mg）；氨磷汀（深圳市资福药业，规格0.5 g）。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（北京伊塔生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；白介素（IL-1）试剂盒（北京义翘神州科技股份有限公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔单克隆抗体（上海碧云天生物科技有限公司）；增强型化学发光法（ECL）化学发光液（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；肿瘤坏死因子（TNF）-α试剂盒（本生健康科技有限公司）；IL-6试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司）；Toll 样受体4（TLR4）、核转录因子κB（NF-κB）p65 兔抗体、山羊抗兔IgG（艾博抗贸易有限公司）；苏木精—伊红（HE）染色试剂盒、RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；聚合酶链式反应（PCR）试剂盒（万类生物科技有限公司）。BX53 显微镜（日本Olympus 公司）；himac CR22N 高速冷冻离心机（艾本德中国有限公司）；200 Pro 多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）；Intas Gel IX Imager凝胶成像仪（德国Royal 公司）；Atellica CH930 全自动生化分析仪（德国西门子公司）；石蜡切片机（瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 顺铂诱导大鼠肾损伤模型制备、分组及自拟调气汤灌胃方法 将90 只大鼠随机分为调气汤低剂量组、调气汤中剂量组、调气汤高剂量组、氨磷汀组、模型组、正常对照组各15只。正常对照组不制备模型，其余5 组均参照文献［2］方法制备肾损伤模型，即尾静脉注射顺铂（2.5 mg/kg），1次/d，连续5 d，检查肾组织病理变化及血清BUN、SCr 水平以验证造模是否成功，若肾组织出现病理性损伤，血清BUN、SCr 显著升高则认为造模成功；造模完成后，调气汤低剂量组、调气汤中剂量组、调气汤高剂量组分别灌胃给予10、20、40 g/kg 调气汤，浓度均为5 g/mL（以生药含量计），氨磷汀组腹腔注射氨磷汀（1 mg/kg）［3］，模型组和对照组给予生理盐水，1 次/d，连续60 d。

1.4 大鼠肾损伤评价指标检测 ①血清BUN、SCR：每组取15 只大鼠，末次给药24 h 后，按照35 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠，取腹主动脉血，4 ℃冰箱静置1 h，以6 000 r/min速度离心10 min（4 ℃），取上清，使用全自动生化分析仪检测血清BUN、SCR。②肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA 检测每组取15只大鼠，末次给药24 h取完腹主动脉血后，以颈椎脱臼法处死大鼠，取肾组织4份（各8.5 g），一份置于冰盒上，加入组织裂解液，组织匀浆器匀浆后充分裂解，以8 000 r/min 速度离心10 min（4 ℃），取上清液，使用ELISA试剂盒检测肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA。③肾组织病理学检查：取“②”处死大鼠肾组织，经甲醛（体积分数为4%）固定，制成4 μm 厚的石蜡切片，按照常规HE 染色方法分别依次使用苏木精、伊红染色后，中性树胶封片，每只大鼠取3张切片，在显微镜下。每张切片随机取5个视野，观察病理性改变。

1.5 大鼠肾组织TLR4 和NF-κB mRNA、蛋白检测 ①肾组织TLR4、NF-κB mRNA：采用RT-qPCR法。取“1.4 中②”处死大鼠肾组织，用PCR 试剂盒提取总RNA 并逆转录成cDNA，根据引物序列，使用PCR 仪检测GAPDH、TLR4、NF-κB mRNA，以2-ΔΔCt表示，采用GAPDH mRNA 表达量作为参照，以TLR4、NF-κB mRNA 与GAPDH mRNA 的比值记为相对表达量。②肾组织TLR4、NF-κB 蛋白：采用Western blot 法。取“1.4 中②”处死大鼠肾组织，充分裂解匀浆后，以12 000 r/min 速度离心10 min（4 ℃），取上清，BCA 试剂盒测定总蛋白含量，取含50 μg 蛋白的裂解液，电泳分离，转膜，牛血清白蛋白封闭，TLR4、NF-κB 及GAPDH 兔抗体按照1︰500的比例稀释后，与蛋白条带在4 ℃冰箱中孵育12 h，PBST 洗涤3 次，5 min/次，室温下山羊抗兔IgG（1︰1 000 稀释）孵育1 h，在凝胶成像仪中使用显影液成像拍照，结果以TLR4、NF-κB 灰度值与GAPDH 的比值表示。

1.6 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清BUN、SCr 水平比较 各组大鼠血清BUN、SCr水平比较见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、SCr水平比较（mmol/L，± s）

表1 各组大鼠血清BUN、SCr水平比较（mmol/L，± s）

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与调气汤低剂量组比较，cP<0.05；与调气汤中剂量组比较，dP<0.05。

?

2.2 各 组 大 鼠 肾 组 织 TNF- α 、IL-6 、IL-1 β 、SOD 、MDA 比较 各组大鼠肾组织TNF- α 、IL-6 、IL-1 β 、SOD 、MDA 比较见表2。

表2 各组大鼠肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA比较（± s）

表2 各组大鼠肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA比较（± s）

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与调气汤低剂量组比较，cP<0.05；与调气汤中剂量组比较，dP<0.05。

?

2.3 各组大鼠肾组织病理学变化 正常对照组大鼠肾组织无异常改变，组织细胞形态正常，无病理性改变；与正常对照组比较，模型组肾小球萎缩，肾间质炎性细胞浸润，并有纤维化改变，肾小管细胞坏死、脱落；与模型组相比，给予大鼠不同剂量的调气汤后，调气汤各剂量组及氨磷汀组肾小球病理学恢复，肾间质纤维化明显减轻，炎症细胞浸润减少。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学变化（400×）

2.4 各组大鼠肾组织TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比较 大鼠肾组织TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比较见表3。

表3 各组大鼠肾组织TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比较（± s）

表3 各组大鼠肾组织TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比较（± s）

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与调气汤低剂量组比较，cP<0.05；与调气汤中剂量组比较，dP<0.05。

?

3 讨论

顺铂作为常用的抗肿瘤药物，其临床常见不良反应为肾损伤，主要以尿量减少、血肌酐升高等肾功能损害为主要临床特征［4］。临床中用于预防和治疗顺铂诱导的肾损伤的药物有限，泮托拉唑、褪黑素、茶碱等药物用于预防和治疗顺铂诱导的肾损伤的临床试验均以失败告终［5］。目前，甘露醇及安磷汀具有显著的肾损伤修复作用，且能够显著降低顺铂引起的肾损伤发生率。使用甘露醇治疗顺铂引起的肾损伤时患者更容易发生水、电解质紊乱，引起低钠血症的发生［6］。研究［7］证实，安磷汀能够显著降低顺铂相关肾毒性的发生率，同时较少引起电解质紊乱。然而甘露醇及安磷汀在临床研究中表现出有效率有限且不良反应大等缺点，因此顺铂诱导的肾损伤治疗药物的研发已成为临床的迫切需求。

自拟调气汤是由本课题组根据中国古典医学著作中记载的多种调脾益肾方剂，以中医学基础理论为指导重新组合的一种具有调脾益气补肾的中药方剂，方中党参、白术、大黄等药材归脾、胃经，具有养血生津、理气健脾、利水祛湿等功效；茯苓、川牛膝、白茅根等药材归脾、肾经，具有凉血清热、化瘀通经、利尿通淋等功效；川芎、丹参等药材归肝、心包经，具有活血行气、凉血通经等功效。BUN 及SCr 作为临床中常用的肾功能评价指标，其水平升高提示肾功能下降［8］；TNF-α、IL-6、IL-1β 是常用的反映体内炎症反应发生及进展的体内敏感的炎症信号分子，炎症反应时TNF-α、IL-6、IL-1β 水平则会显著升高［9］；SOD 作为肾组织中典型的抗氧化损伤分子，其是敏感的氧化应激损伤标志物，组织细胞受损时其水平降低，MDA 是机体脂质氧化的终产物，其水平的升高是细胞氧化损伤的典型表现［10］。本文结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清BUN 及SCr 水平升高，提示肾功能下降；同时肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β 及MDA 升高，SOD 下降，提示大鼠肾组织出现明显的氧化应激损伤及炎症反应。与模型组比较，给予大鼠不同剂量调气汤后，大鼠血清BUN 及SCr水平明显降低，肾功能明显好转，同时肾组织炎症因子水平下降，MDA 水平降低，SOD 水平升高，提示调气汤起到活血化瘀，利尿通淋，行气生津之功效，进而修复大鼠肾组织的炎症损伤及氧化应激损伤。

TLR蛋白家族是机体产生非特异性免疫过程中不可或缺的重要蛋白家族，也是连接特异性免疫及非特异性免疫的重要信号传递分子，TLR4是该家族的主要成员之一［11］。近年来研究［12］发现，TLR4的异常激活是诱导肾脏损伤的重要因素，同时机体炎症反应的产生及传递也与该蛋白密切相关。NF-κB通路及上下游相关蛋白的激活与炎症反应加重有关［13］。在正常机体细胞中，NF-κB 与其抑制蛋白以非活性复合物的形式存在，在外源性刺激及毒性代谢产物的作用下，会促进其抑制蛋白的磷酸化，进而与NF-κB 解离，激活NF-κB 通路。研究［14］表明，NF-κB 能够通过诱导激活天然免疫系统，从而介导急、慢性肾脏疾病的发病过程，并与多种肾脏疾病的发病及疾病转归密切相关。陈华等［15］发现，TLR4、NF-κB 水平的升高与大鼠肾组织炎症损伤密切相关，抑制TLR4、NF-κB的异常激活能够改善大鼠肾功能，缓解肾组织损伤；姜瑞凤等［16］认为，TLR4/NF-κB通路的异常激活会导致肾损伤的发生，而松果菊苷能够通过抑制TLR4/NF-κB 通路进而发挥其抗炎及肾损伤修复作用，由此可见TLR4/NF-κB 通路在肾损伤相关疾病的发生发展中起着重要作用。本研究给予顺铂引起的肾损伤大鼠调气汤，大鼠肾组织TLR4、NF-κB 随调气汤剂量增加逐渐降低，同时体内炎症因子减少及抗氧化应激相关分子水平则明显升高，表明调气汤能够呈剂量依赖性抑制顺铂诱导肾损伤后肾组织TLR4/NF-κB 通路的激活，逆转顺铂对肾组织造成的病理性损伤，同时修复受损肾细胞，恢复肾功能。

总之，自拟调气汤具有显著的肾功能恢复作用，其可能通过调节TLR4/NF-κB 信号通路，提升肾组织抗氧化应激能力，抑制炎症反应的发生及进展，进而修复肾组织病理损伤。