微生物强化植物修复铅污染土壤的机制研究进展

江润海 姜冉冉 朱城强 侯秀丽

（昆明学院农学与生命科学学院 高原湖泊生态与环境健康云南省高校协同创新中心，昆明 650214）

土壤与人类的生存和发展息息相关，当前全球大量土壤受重金属污染严重。由于重金属的不可降解性、毒性、持久性和在食物链中的生物累积性，一旦通过食物链进入机体的重金属含量超出人体可接受的最大容纳量时，会引发各种疾病，对肝、肾、神经组织等造成损伤，潜在危害极大。据估计，欧盟有350万个地点可能受到污染，其中50万个地点受到高度污染［1]。在美国，约有60万hm2的土地（尤其是棕地）受到了重金属污染［2]。2014 年 4 月 17公布的《全国土壤污染状况调查公报》［3]表明，全国土壤重金属总体超标率为16.1%，Cd、Hg、As、Cu、Pb、Cr、Zn和Li的超标分别达7.0%、1.6%、2.7%、2.1%、1.5%、1.1%、0.9%和4.8%，其中Pb是五大重点监控重金属之一，其毒性极强［4-5]。土壤中过量的重金属元素，对粮食生产和人类健康带来了潜在威胁，土壤重金属污染问题亟待解决［6-7]。

植物修复是一种绿色环保的重金属修复技术，在利用植物修复土壤中重金属污染的同时，对生态环境具有无害和安全的优点。但是在使用植物修复的过程中，污染物容易在植物中储存和积累，植物受到多种污染物的胁迫使修复效果不明显［8-11]。因此，研究者提出改变植物根际微生态环境以提高植物修复效率，根际微生物分泌的有机酸可以降低土壤的pH，活化并促进植物对重金属吸收，微生物分泌物还能与微量元素Cu、Zn、Mn、Co等络合，提高根际环境中这些元素的生物有效性，同时微生物特殊的细胞结构可以通过吸附、沉淀、络合等将重金属固定，降低重金属对植物的毒害作用。微生物协同植物修复重金属污染可以作为一种有效的生物替代方法来修复土壤中的重金属［12]。但微生物对重金属的吸附机制和微生物与植物之间对重金属的修复机理并不明确，本文以Pb为例综述了微生物吸附重金属的主要吸附机制和植物根系与微生物系统修复重金属Pb的机理，旨在为我国修复土壤重金属污染提供参考。

1 不同微生物对Pb的吸附作用

微生物特殊的细胞结构对重金属具有吸附作用，微生物吸附重金属的过程最初发生在与细胞壁表面的结合位点，随后金属离子被膜运输至细胞质［13-15]。具有吸附重金属能力的微生物主要包括细菌、真菌和藻类等，不同类型的微生物对各种重金属都表现出良好的生物吸附能力［16-19]（表1）。例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能够在低温下去除Pb，而且在弱酸性或近中性污染的土壤中辅助植物修复Pb。Tunali等［22]利用从土壤中分离出的芽孢杆菌（Bacillus sp.），在pH值为3.0、吸附温度为25.0℃时对Pb2+具有最大吸附量。Kang等［20]从金属矿山土壤分离出阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），并利用阴沟肠杆菌的尿素酶活性的生物矿化去除Pb，结果表明，在30℃下培养48.0 h后，Pb的去除率约68.1%。

表1 不同微生物吸附剂对金属Pb的生物吸附Table 1 Biosorption of metal lead by different microbial adsorbents

真菌对重金属也具有较强的吸附作用。Akar等［23]研究发现Pb2+积累在灰霉病菌（Botrytis cinerea）表面，当pH值为4.5、接触时间为1.5 h、接触温度为25℃时，Pb2+的含量从350.0 mg/dm3降低到107.1 mg/dm3。Iqbal等［24]用黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）测试了一种新的生物吸附系统，研究海绵固定化真菌（fungal biomass immobilized within a loofa sponge, FBILS）对重金属的吸附性能，结果表明，当pH为6.0、吸附时间为60.0 min时，FBILS对Pb的吸收达到最大为135.3 mg/g。Dursun等［25]分析比较了Cu2+、Pb2+和Cr2+的生物富集性，黑曲霉（Aspergillus niger）对3种金属离子的积累量大小为：Pb2+＞Cu2+＞Cr6+，表明黑曲霉是一种有效的Pb2+生物吸附剂。

藻类微生物对重金属的结合能力主要取决于细胞壁的性质［28]，其细胞壁几乎由磺化多糖的纤维素组成，存在大量的氨基、羧基、羟基和羰基等官能团，这些官能团作为金属离子的结合部位，对金属离子具有一定的吸附作用［15]。不同类型的海藻生物量对Pb2+的吸附量表现的吸附功能存在较大差别：褐藻（Phaeophyta）＞绿藻（Chlorophyta）＞红藻（Rhodophyta）［29]，褐藻含有丰富的基质、多糖和胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）因此对于Pb2+具有较强的吸附能力［28]。

2 微生物吸附重金属Pb的机制

微生物对土壤中重金属的修复和解毒具有重要作用，微生物修复重金属Pb的机理和过程主要通过生物吸附进行［30-32]。生物吸附过程指细胞壁与金属离子相互作用的总和，包括静电相互作用、离子交换反应、络合反应、氧化还原反应和沉淀作用［33-37]。

2.1 静电相互作用

微生物的细胞壁结构成分是生物吸附重金属的第一道防线，对重金属吸附起着重要作用。生物吸附是细胞外隔离重金属以限制其进入细胞而减少毒害的一种途径。细胞壁表面存在带负电荷的官能团，如羧基、羟基、氨基、巯基和磷酰基等［36,38-40]，这些带电官能团吸引金属阳离子，并通过其他驱动力进一步键合重金属。Maldonado等［41]从微生物群中分离出一株细菌菌株（DE2008），研究表明该细菌产生的EPS中含有带负电荷的糖醛酸和硫酸基团，与重金属离子发生静电相互作用，从而有效地吸附Pb2+。官能团的结合还受到反应介质环境制约，环境pH值会对金属物质和微生物细胞壁官能团的电荷性质产生影响。例如在生物吸附过程中，在较低pH值（1.0-3.0）下，由于-NH2等官能团在细胞表面被质子化，阴离子通常比阳离子更易被吸附，如Pt和Pd在pH值为1.6-1.8更易被吸附，而阳离子则在较高的pH值（3.0-7.0）下易被吸附，如Pb和Cu的最适pH值为5.0，Cd、Zn和Ni在pH值为5.5时最佳［40]。

2.2 离子交换反应

在重金属胁迫下，微生物通过代谢活动改变代谢产物，增强对重金属Pb的离子交换作用。由微生物分泌代谢并由细胞裂解产生的高分子量聚合物EPS，具有很高的生物絮凝活性并对微生物细胞具有重要作用［42-43]。EPS由多糖、蛋白质、核酸、腐殖质、脂类和其他低分子成分组成，通常含有5%-25%的糖醛酸残基，酸性的EPS极易与金属离子结合［44-47]。在低pH条件下，由于排斥力的作用，细胞壁上的配体被质子化，金属阳离子不被EPS吸附，随着pH值的升高，使得EPS中暴露出更多的配体，并携带负电荷，从而吸附更多的金属离子［48-50]。微生物在吸附重金属的同时伴随着其他阳离子的释放，发生离子间的相互交换作用［35-36,51-52]。陈志［53]分别对两种芽孢杆菌（B. cereus12-2和B. thuringiensis016）细胞在有无Pb2+条件下释放K+、Na+、Mg2+进行实验，在无Pb2+条件下，B.cereus12-2和B. thuringiensis016细胞只释放少量的K+（≤0.3 mmol/L）和Na+（≤0.1 mmol/L）；在Pb2+存在条件下，随着细胞对Pb2+的吸附，B. cereus12-2和B. thuringiensis016细胞释放的K+逐渐增加，当Pb2+浓度降为0 mg/L时，细胞释放的K+浓度趋于平衡，Mg2+浓度少量增加，而Na+浓度有所下降，表明两种芽孢杆菌吸附Pb2+的过程中，K+、Mg2+和Na+可能参与对Pb2+的离子交换或转运。Qiao等［54]以一株耐铅细菌枯草芽孢杆菌X3为菌种，制备了一种用于固定化和去除Pb的生物吸附材料，使用EDS图像分析细胞表面的化学成分，与对照组相比，P、Ca和Pb的百分比增加，而Na的百分比从3.16%下降到1.66%，结果表明Pb、Ca和Na之间存在离子交换，不仅形成了铅-羟基磷灰石，还形成了Ca3(PO4)2，细胞壁表面的Na+和Ca2+在溶液中与Pb2+交换，证实了离子交换过程发生在矿化之前。

2.3 络合反应

络合反应是微生物胞外分泌物和微生物细胞壁上的官能团与金属间形成络合物的过程，是生物质表面金属-配体相互作用吸附重金属的重要现象。Pb2+通过与细胞表面的羟基、羰基、羧基、胺和磷酸基团等官能团之间的络合反应，通过配位键形成稳定的络合物［55]。在土壤微生物分泌的大量含羧基的化合物，例如酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸等，其在中性pH溶液中带负电荷，通过静电相互作用吸引带正电荷的金属阳离子形成有机金属络合物［51]。通过X射线衍射谱分析发现，苏云金芽孢杆菌在吸附Pb2+的过程中，与细胞官能团通过络合反应形成不溶物Pb5(PO4)3、Pb10(PO4)6(OH)2和Pb5(PO4)2Cl［54]。Xing等［56]在研究两株菌株H13和H16对重金属的吸附实验中发现，两个菌株都能产生胞外多糖，并在金属胁迫下显著增加，将有毒的可移动重金属离子转化为不可移动的络合物，可以降低其对细菌的毒性，实现重金属的固定化，两株菌株产生的无机不稳定硫化物与二价阳离子重金属具有极好的结合效率，可与Pb2+络合形成PbS沉淀。

2.4 氧化还原反应

变价金属离子被具有还原能力的微生物吸附后，可能发生氧化还原反应［57]。微生物通过氧化还原反应改变或转化土壤中重金属的价态，使其毒性降低，或将金属离子还原或转化成磷酸盐、硫化物等形式［58-59]。据报道，微生物分泌代谢的EPS可以将重金属从高价还原为低价，Pb2+到Pb0，U6+到U4+［60]，Cr6+到Cr3+［61]，并因其丰富的官能团而吸附在EPS上，重金属被还原为低价后其毒性相对降低。硫酸盐还原菌（sulfate reducing bacteria, SRB）可通过与游离金属离子发生氧化反应生成不溶性金属硫化物沉淀如PbS［62]。Govarthanan等［63]研究发现，从尾矿分离的芽孢杆菌KK1，可通过氧化还原将可溶性Pb转化为硫化物和碳酸盐或者硅酸盐形式，该过程使Pb可交换态降低34.0%，可以对高含量土壤中的Pb起到矿化作用。

2.5 沉淀作用

在微生物修复重金属过程中，微生物可以将有毒的金属离子转化为不溶性的沉淀物，如磷酸盐、碳酸盐和硫酸盐。研究发现，真菌类微生物细胞壁可以充当结合金属离子的配位体，并且通过主动吸收、胞外和胞内沉淀将重金属吸附到菌丝体和孢子中从而将重金属固定在细胞内［14]。海洋细菌哈氏弧菌（Vibrio harveyi）是一种有效的Pb沉淀转运抑制剂，并且能够和Pb结合生成Pb9(PO4)6化合物而沉淀Pb［64]。Park等［65]发现土壤微生物分泌物会促进金属Pb与硫化物、氢氧化物和碳酸盐形成复合物而有效固定Pb，从而降低了Pb2+的生物有效性。耐金属Pb的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对Pb2+具有较强的吸附作用，使Pb在菌株中形成生物沉淀固定Pb［66]。金属雷氏菌（Ralstonia metallidurans）CH34对Pb2+具有吸收、外排和积累的功能，当介质pH值为9.0时，金属雷尔氏菌CH34与氢氧化物或碳酸盐反应生成复合物沉淀固定Pb［67]。土壤解磷菌可将土壤中难溶的磷酸盐转化成可溶的磷酸根离子，而磷酸根离子又可与土壤中的可交换态Pb2+反应形成稳定的Pb3(PO4)2沉淀，有效降低土壤中可交换态Pb的质量分数，降低了其生物可利用性［68]。

3 植物修复Pb污染过程中微生物缓解Pb对植物毒害的作用

3.1 产生促生因子提高修复植物生物量

植物根系与微生物两者之间相互协作，可以提高植物生物量和重金属耐受性，以达到吸收、固定和降低重金属在土壤中的浓度，减少其毒害作用［69-70]。微生物从植物根系分泌的初级代谢产物和次级代谢产物中获取所需的营养物质，微生物在感知植物根系释放的信号后会释放相关物质并将其转化成植物所需的营养物质从而对植物的生长和抗性产生影响［71-72]。Akiyama等［73]研究发现，银杏（Ginkgo biloba）根系分泌的倍半萜内酯类化合物，可以促进丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungus, AMF）孢子萌发以及菌丝分枝的形成，同时使菌根定殖和促进植物根系对营养物质的吸收，提高植物的生长速率。

微生物分泌植物生长激素（吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素等）促进植物生长，提高植物的生物量和抗性，增强植物对重金属的富集作用。同时，微生物分泌的铁载体可与土壤中的Fe3+等金属离子螯合，促进植物对营养元素的吸收。乙烯可以加速植物的衰老与死亡，微生物分泌的ACC脱氨酶能够分解乙烯合成前体ACC为α-丁酮酸和氨，从而有效缓解植物体内乙烯的积累，减轻逆境下乙烯对植物的伤害，促进植物的生长和产量的提高，并在促进植物抗盐碱、干旱及重金属胁迫等方面都有显著作用［74-76]。Liu等［77]发现接种叶状杆菌（Phyllobacterium myrsinacearum strai）RC6b能够显著提高紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和东南景天（Sedum alfredii）的生物量，接种RC6b后紫花苜蓿生物量中Pb含量增加了13.8%-24.7%，东南景天生物量中Pb含量增加了18.6%-31.2%，表明接种RC6b显著提高Pb的吸收和积累。在相同重金属胁迫条件下，接种耐Pb根际细菌菌株不仅能够显著促进向日葵（Helianthus annuus L.）叶片光合作用，还能提高Pb胁迫植株的生物量和对重金属的抗性，减弱Pb对植株的毒害作用［78]。Shabaan等［79]在土壤Pb浓度分别为250、500和750 mg/kg时，豌豆（Pisum sativum L.）根际接种荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence）后，与未接种菌株的对照处理相比，豌豆地上部鲜重增加了51%、45%和35%，根鲜重增加了56%、100%和139%，籽粒鲜重增加了96%、104%和142%，籽粒干重增加了91%、59% 和73%，每盆粒数也分别增加163%、200% 和329%。同时，在相同条件下，土壤中可提取态Pb含量比未接种对照组降低57%、56% 和50%，接种处理后豌豆籽粒中Pb的含量分别比未接种对照组降低57%、55%和 49%。结果表明，豌豆在不同浓度的土壤Pb中表现出了更好的生长和产量。同时，菌株还能够有效地减少土壤中可提取态的Pb含量，并降低植物体内和籽粒的Pb含量。

3.2 改变土壤中Pb的化学形态降低植物毒害

微生物特殊的细胞结构及其胞外聚合物等，可以将重金属吸附在细胞表面或积累在细胞中，降低重金属对植物的毒害作用。一些解磷微生物还能释放出磷酸酶，将土壤中的难溶性磷酸盐溶解，溶解后的磷酸盐与土壤中的Pb发生反应，形成磷酸铅化合物沉淀，从而有效降低土壤中Pb的有效性［80]。Szuba等［81]在银灰杨（Populus canescens）上接种适当的耐Pb真菌将Pb2+固定在真菌细胞中，并对寄主植物的生长和Pb的稳定性以及缓解Pb2+植物毒性都具有显著的影响。李益斌［82]在研究解磷菌对Pb的钝化效果中，解磷菌存在条件下可以生成Pb(PO3)4Cl沉淀，且该沉淀结构稳定，不再溶解，固定重金属的同时不仅活化了土壤中的磷酸盐，促进植物对磷素的吸收。植物根系和微生物分泌的有机酸可以酸化根际土壤环境，与重金属形成络合物，改变土壤中重金属的存在形态，增加其有效性，从而促进植物对重金属的吸收［83]。施积炎等［84]研究了海州香薷（Elsholtzia splendens）和鸭跖草（Commelina communis）根分泌物，以及假单胞菌（P. aeruginosa ZD4-3）对污染土壤重金属活性的影响发现，海州香薷和鸭跖草根分泌物对污染土壤中重金属有一定的活化能力，假单胞菌对污染土壤中的Pb有很强的活化作用，促进了植物对重金属的吸收量。姚洁等［85]将寡养单胞菌属（Stenotrophomonas pavanii）分别与袖珍椰子（Chamaedorea elegans Mart）和凤尾蕨（Pteris cretica L.var. nervosa）构建联合修复体系发现，接种耐Pb微生物后与对照组相比，袖珍椰子地上部分在Pb2+浓度为2000 mg/L时Pb含量增加了112.61%，凤尾蕨地下部分在Pb2+浓度为200 mg/L时体内Pb含量增加了113.01%，植物-耐Pb微生物联合修复Pb污染土壤效果显著。

3.3 诱导植物抗性系统（ISR）及调控基因表达降低毒害

植物根际促生菌能够通过诱导植物抗性，上调胁迫响应相关基因表达，调节植物体内过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）和抗坏血酸过氧化物酶（PPO）的活性，使重金属诱导的氧化压力下脂质过氧化丙二醛（MDA）的产生减少，降低重金属胁迫下对植物的毒害作用［86-87]。接种耐Pb微生物后，袖珍椰子的过氧化氢酶（CAT）活性在Pb2+浓度为200 mg/L时达到最大值，为对照组的1.33倍；凤尾蕨过氧化物酶（POD）活性在Pb2+浓度为400 mg/L时是对照组的2.64倍；袖珍椰子在Pb2+浓度为400 mg/L时超氧化物歧化酶（SOD）活性是对照组的1.53倍，植物-耐Pb微生物联合修复增强了植物的光合作用及对Pb2+的富集作用，提高了植物抗氧化酶系统的活性，增强了植物对Pb的耐受力。

同时已有研究表明接种植物促生菌能够调控植物部分基因的表达。研究表明AMF在植物根际定植可以缓解重金属诱导的压力，并且对部分植物基因的表达有重大影响，这些基因编码的蛋白质可能参与重金属耐受和解毒，目前关于AMF耐重金属机制分子基础方面的信息十分有限［88-90]。Ouziad等［91]研究了重金属胁迫下AMF侵染番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的差异基因表达，无论是在重金属含量特别高的自然土壤上还是添加Cd污染土壤上生长时，接种AMF的植株比未接种AMF的对照，能够更好地适应环境并生长良好。该实验被用来分析推测与重金属耐受性有关的基因的转录本形成，通过Northern杂交分析表明，番茄基因Lemt2（编码不同的金属硫蛋白）和LeNramp1（编码广泛的重金属转运蛋白），在没有AMF侵染植物的所有根组织中都有强烈的表达，而这些基因在AMF侵染的植株根中的薄壁细胞中只有少数被表达，侵染部位明显降低了该基因的转录水平。AMF在根部定植可能将植物细胞中的重金属浓度降低到不足以诱导这些基因的表达水平。在含有被认为与缓解重金属胁迫有关的基因中，一些基因在接触重金属时强烈表达，并且通过与真菌共生而下调。例如在铜诱导下，共生菌丝体中金属硫蛋白基因（BeG34）的表达上调，在短时间和长时间的锌胁迫下，海藻菌丝体中可能存在阳离子扩散促进因子家族（CDF）的锌转运蛋白基因（GintZnT1）的转录水平增加，这表明该酶可能在保护锌胁迫中发挥作用［92]。

3.4 根际微生物-植物根系共生系统在修复Pb污染土壤中的作用

微生物-植物根系共生系统是一种修复重金属的有效手段。一些根际微生物如植物根际促生菌、固氮菌、根瘤菌等具有改善植物营养，促进植物生长、提高植株生物量和降低重金属对植物的毒害的作用［93]。在重金属污染的土壤中，微生物可以通过不同的方式促进植物的生长和土壤修复。豆科植物根瘤中的固氮菌可以增加Pb元素在植物体内的稳定性，从而减少其向地上部分转移，同时也有助于提高植物发育［94]。AMF与植物形成共生关系后，能够帮助寄主吸收更多养分，并限制有害金属向地上部分转移［95-96]。此外，在保护适当的土壤质地、防止淋溶以及将重金属转化为无毒性等方面也起到了积极作用［97]。豆类植物进行土壤修复时还可与根瘤菌形成共生关系来促进氮素经济和提高土壤肥力以及作物产量［98]。中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）显著提高了紫花苜蓿的结瘤效率，并增加了其对重金属的生物积累能力，从而促进了土地恢复和潜在农业产出［99]。Zhang等［100]在不同浓度Pb污染土壤中种植玉米（Zea mays L.）接种AMF后，通过透射电子显微镜观察菌根后发现Pb主要积累在AMF的菌丝壁、菌丝内室、菌丝内室膜和液泡内室膜中。丛枝菌根固定Pb的能力可以减少Pb从土壤向根系的迁移，从而减轻Pb对玉米的毒性。

由上述可以看出，微生物-植物联合修复技术对土壤重金属污染的修复发挥着重要作用，其主要机制作用如图1所示。

图1 微生物-植物联合修复土壤重金属污染的机制Fig. 1 Mechanism of microbial-plant combined remediation of soil heavy metal pollution

4 展望

重金属Pb污染土壤是一种严重的环境问题，对人类健康和生态系统造成严重危害。传统的修复方法包括物理、化学和生物等多种手段，但这些方法存在着高昂的成本、副作用大以及效果不稳定等缺点。因此，微生物联合植物修复Pb污染土壤已成为备受关注的研究领域。而未来微生物联合植物修复重金属污染土壤应当着重从以下4个方面开展：一是，深入研究微生物-植物互作机制。目前对于微生物-植物互作机制仍然存在很多未知之处，在深入探索这方面内容时需要综合运用分子遗传学、基因组学和代谢组学等现代技术手段。二是，优化菌株筛选。当前已经发现了许多具有降解或吸收能力的菌株，但这些菌株适应性差、活性低下等问题也比较突出。今后需要加强对于优质菌株筛选工作，并针对不同类型污染场地进行相应调整。三是，探索新型修复材料。除了常规使用天然植物外，还可以尝试引入一些非天然材料如纳米材料进行修复工作。同时结合其他治理技术如电动力法和超声波处理法也值得进一步探讨。四是，加强实践应用。虽然该技术已经在一定程度上取得成功, 但要真正推广起来仍需更多实践验证, 并建立完善评估体系。总之，微生物联合植被治理重金属污染具有可持续性、高效率、低成本、易操作、安全环保等诸多优势，在未来必将得到更广泛的推广与应用。