辐射诱导植物叶色突变的研究进展

展艳 周利斌 金文杰 杜艳 余丽霞 曲颖 马永贵刘瑞媛

（1. 青海师范大学生命科学学院，西宁 810016；2. 中国科学院近代物理研究所生物物理室，兰州 730030；3. 中国科学院大学，北京100049）

辐射可以诱发丰富的植物表型及基因变异，且由于育种过程中突变率高、突变谱广和育种周期相对较短［1]，被广泛应用于植物学研究、遗传多样性的拓展及种质创新。辐射源、辐射材料与剂量的选择都会直接或间接影响诱变效果。目前，利用辐射诱变技术培育了高产量、高抗性、矮化、叶色突变等指标的新品种，成为植物育种的重要手段。叶色突变作为一种常见的突变性状，可以作为标记性状来达到简化良种繁育的目的，具有重要的研究价值。本文从辐射诱变育种、在辐射诱导下植物叶色突变的类型以及对叶色突变生理与分子机制的研究等方面进行综述。

1 辐射诱变概述

辐射诱变育种是指利用辐射方法，对生物样本进行辐照诱变，经筛选、培养、稳定后使其产生有利突变并稳定遗传而成为新品种的过程［2]。1928年，X射线和γ射线诱导大麦和玉米发生变异，揭开了植物辐射诱变育种研究工作的序幕［3-5]。我国辐射生物学始于20世纪50年代中后期，60年代辐射诱变才广泛应用于农作物的育种工作［6]。目前，辐射诱变已应用于多种植物遗传改良工作，并取得重要的阶段性成果。

辐射一般可分为非电离辐射和电离辐射，非电离辐射是指对被辐照物产生分子振动、转动或者电子能级状态改变而不引起物质分子电离的辐射，如紫外线、激光、微波等本身能量较低，作用机理主要是电子激发后形成激发分子，导致DNA分子内部化学键的断裂。电离辐射是指能直接或间接引起物质发生电离造成DNA损伤的辐射［7]，如射线、中子和重离子束等本身具有较高的能量。随着核技术领域的发展，辐射效应的硬件设施和理论水平都有了显著的提高，极大地促进了辐射诱变技术的发展。目前，辐射诱变技术已日趋成熟，培育出高产量、高抗性、矮化、叶色突变等指标的新品种，成为育种领域不可或缺的重要组成部分。

2 叶色突变的辐射诱导

2.1 主要的辐射诱变源

叶片是植物进行光合作用的主要场所，对植物的生长具有重要意义。叶色变异是植物诱变育种的一种常见的突变性状，杂交育种可以用叶色突变作为标记性状来简化良种繁育［8]，达到去除假杂种、保证种子纯度的目的，通过特殊优良性状的叶色变异为育种工作提供优秀的种质资源［9]。与其他突变方式相比，辐射诱变由于方法简便、育种时间短、突变效率高且突变性状丰富等特点应用广泛。目前，应用于植物诱变育种的常用射线有X射线、γ射线、中子和离子束等，其中，重离子束是一种新的高能辐射源。X射线的辐射源是受激发的电子云，能量较高，直进性、穿透性较强，能引起植物电离。闵可怜［10]用X射线、γ射线处理后的唐菖蒲在M3代的叶色变异性状可以稳定遗传。γ射线的辐射源是放射性同位素，如137Cs、60Co，不带电荷又无质量，能量比X射线要高，具有很强穿透力。孙叶等［11]用60Coγ射线对春兰‘雪山’的带小芽植株辐照后出现斑缟、片缟、中斑、粉斑等叶色变异且性状稳定。中子的辐射源是核反应堆中子源或中子发生器，穿透力很强，按能量大小分为快、中能、慢和热中子。刘忠祥等［12]用快中子辐照玉米自交系后，M2、M3代出现叶色白化、黄化的突变体。离子束是质量数≥4的带电粒子低能注入、高能贯穿，具有能量动量转移、电荷交换及质量沉积三重效应，相对生物学效应高。崔涛［13]用中能碳离子束辐照百脉根干种子，对M2代植株群体进行突变体筛选，最终得到了稳定遗传的叶片黄化变异植株C16。

2.2 辐射材料与剂量的选择

辐射材料的选择对诱变育种的成败具有重要的作用，选择遗传背景明确、综合性状与适应性好的材料有助于提高诱变效率。植物的各个部位都能用合适的辐照方法进行诱变处理（图1）。常用的材料有种子、花粉、植株或块茎等营养器官，愈伤组织或原生质体等离体培养材料［14]，不同的材料对辐射的敏感度也不同［15]，耿兴敏等［16]研究表明辐射处理对不同品种桂花种子的萌发率存在显著差异。种子含水量也会影响辐照效果，Kiani等［17]研究表明种子在不同含水量下，随着伽马辐照剂量的增加，幼苗成活率和幼苗长度均呈下降趋势。育种目标确定的前提下，应根据所需辐照材料的特性及预期试验目的作出最佳选择。

图1 辐射处理植物的基本流程Fig. 1 Basic process of radiation treatment of plants

选择适宜的辐照剂量同样有利于诱变效果，在一定范围内，增加辐射剂量会提高突变率，但也会导致植物的生理损伤或死亡，相反，则会使突变体较少。因此，在对植物没有严重损伤的前提下，要选择得到较多突变体的辐射剂量。但是，由于辐照材料的遗传差异和生长环境的不同会影响突变率，很难找到最佳辐射剂量，研究表示可以根据材料的半致死剂量（lethal dose 50%，LD50）来确定适宜的辐射剂量，Mohd等［18]研究一种常见草坪草的形态特征变化时设置了不同的γ射线辐照剂量，结果显示，半致死剂量为90 Gy时的诱变率最高。李春盈等［19]认为辐射后出苗率在40%左右可以作为辐射剂量可行的参考依据。

3 辐射诱导叶色突变的类型

叶色突变体通常在苗期便表现出与野生型不同的颜色，易于分辨，因此，苗期的叶色一般作为叶色突变体最常见的划分标准。Awan等［20]依据叶片表型差异将叶色突变体细分为浅绿、条纹、斑点、黄化、白化、黄绿、绿白以及白翠等8种类型（图2）。Sun等［21]运用60Co辐照，从水稻9311品种衍生了一种新的斑点叶突变体spl32，幼苗期从尖端到基部的叶子上覆盖着坏死斑点，斑点从植物的底部到顶部出现。根据突变体对温度和光照反应的特性，划分为温度敏感型突变体［22]和光敏感型突变体［23]。Morita等［24]从碳离子辐照产生的水稻突变种群中获得一种冷敏型突变体csv1，该突变体在30℃条件下于第五叶阶段后发育出正常的绿叶，表明在生长和分蘖期早期对低温有响应。Zhou等［25]在60Co辐照下获得光诱导黄叶突变体lyl1-1，LYL1编码香叶基还原酶，影响水稻叶绿素的合成和光敏感性。研究者还依据植物叶色突变遗传的方式，分为细胞核遗传、细胞质遗传和核质互作遗传3种方式，一般多数属于细胞核遗传，Nakamura等［26]研究发现转录因子基因OsGLK1通过提高核编码基因的转录水平来调节叶绿体发育，并通过激活核编码的sigma因子基因的表达来调节光合作用机制的质体编码基因。Abe等［27]在辐射诱变下获得的水稻白化突变体（CMD）受两对隐性核基因的控制。根据突变体存活状况还可分为致死突变、非致死突变及条件致死突变，苗期白化即为致死突变。到目前为止，叶色突变体主要是依据叶色表型与叶色突变机理来进行系统分类的。

图2 辐射诱变叶色突变的类型Fig. 2 Types of radiation-induced leaf color mutations

4 辐射诱导叶色突变机制

叶色突变机制比较复杂，植物生理和遗传之间的互作导致植物叶色发生突变，并且不同的突变机制可能会引起相同的叶色变异。研究表明，辐射诱导下叶色突变的生理研究主要涉及光合色素含量、叶绿体结构和光合特性。分子机制主要与叶绿素生物合成、叶绿素降解、叶绿体的分化发育等有关。

4.1 叶色突变生理机制

植物叶色突变体在叶绿素的合成或降解等途径的直接或间接影响下，最终生理表现为光合色素种类、含量和比例的变化，叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b，是参与光合作用的主要色素。叶绿体作为植物进行光合作用的主要细胞器，叶色变异时叶绿体结构和数目可能会产生不同程度的变化。而植物叶片的光合色素和叶绿体结构对植物的光合能力和光合效率具有重要的作用。Gong等［28]在60Co γ射线下产生的水稻白化突变株asl1中，Chl a、Chl b和Car的含量都接近于零，白化表型是由总Chl含量降低引起的。在观察叶绿体超微结构时发现叶绿体发育似乎在前体阶段停止，突变体中未观察到正常的叶绿体。Xia等［29]研究发现蔷薇的叶片在经60Co γ射线辐照后叶绿素含量显著降低，且分析了叶绿素合成与代谢关键酶的基因表达后发现突变株叶绿素含量的降低可能是60Co γ射线抑制叶绿素合成和增强叶绿素降解的结果。辐射诱变产生的一种源自硬质小麦的新型黄绿色突变体ygld的生理研究发现，突变体中色素含量（包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和总叶绿素）降低。但chl a/chl b比值与野生型相比增加；透射电镜分析表明叶绿体的形状与结构均有变化，形状由椭圆形变为圆形，且类囊体堆大小不一，在基质区显得杂乱无章；光合作用分析表明突变体的光合速率、荧光动力学参数均显著降低，光合能力下降［30]。

4.2 叶色突变分子机制

4.2.1 叶绿素生物合成的变化 高等植物质体中包括4类四吡咯化合物，即叶绿素、血红素、西罗血红素和光敏色素生色团。它们的共同前体原卟啉IX与Mg2+螯合形成镁原卟啉IX，最终形成叶绿素；与Fe2+螯合形成血红色素，最终形成光敏色素生色团［31-32]。叶绿素生物合成过程是四吡咯物代谢中的关键一环，叶绿素顺利合成是从谷氨酰-tRNA开始，经过多步的酶促生化反应过程，最终形成叶绿素a和叶绿素b［33]。如图3所示，在叶绿素合成过程中缺少任何一种酶都可能导致叶绿素合成受阻，造成叶绿素比例的失衡形成叶色突变体。YGL1、YGL2、YGL6、YGL7、YGL8、CHL1、CHL9等克隆的叶色突变基因都参加叶绿素合成的生物合成途径［34-39]，形成黄绿叶色变异表型。其中，ygl2突变体出自60Co辐照的突变体库，黄绿叶色表型在三叶期最明显，抽穗期接近野生型的正常水平，序列分析表明，在YGL7的第一个外显子1 kb插入，导致突变体YGL2表达显著降低，光合作用相关基因的表达水平发生变化。金叶弯刺蔷薇是通过γ射线辐照弯刺蔷薇的种子后得到的金叶突变体，通过比较转录组分析，结果表明，叶绿素和类胡萝卜素合成途径关键酶基因的表达减弱，直接导致色素下降，同时，大多数DEGS还影响叶绿体的发育最终产生叶色变异［40]。60Co辐照群中筛选出的水稻ylc1突变体的叶片颜色自出苗至分蘖期表现为黄色，抽穗后叶片变为绿色，实时荧光定量PCR表明，不同温度影响突变体中与叶绿素合成相关基因的表达水平［41]。叶绿素的生物合成和分解是一个动态平衡过程，打破平衡状态就会产生叶色变异。

图3 高等植物叶绿素生物合成途径Fig. 3 Chlorophyll biosynthetic pathways in higher plants

4.2.2 叶绿素降解的变化 叶绿素降解是叶片衰老和果实成熟的最明显迹象之一（图4）［42-43]，主要分为两个阶段，首先叶绿素a（chlorophyll a, CHl a）在叶绿素酶（chrolophyllase, CS）和脱镁螯合酶（Mg-dechelatase, MCS）的作用下分解成脱镁叶绿酸a。然后在脱镁叶绿酸a单加氧酶（pheide a oxygenase, PaO）和叶绿素代谢产物还原酶（chlorophyll catabolite reducase, CCR）的催化下生成中间产物初级荧光叶绿素代谢物（primary fluorescent catabolite,pFCC）。第二个阶段pFCC在液泡中形成非荧光叶绿素分解代谢产物（nonfluorescent chlorophyll catabolites, NCC），最终转化为氧化降解产物。叶绿素降解过程中，基因发生突变会出现叶片滞绿现象，典型特征为叶绿素降解速率变慢，叶片较长时间内维持绿色性状。Jiang等［44]从水稻60Co辐射群中筛选出一株滞绿突变体，由SGR中A251-G251的单核苷酸替代导致水稻产生滞绿表型，过表达会减少叶片类囊体膜的数量，增加水稻衰老期间的叶绿素分解，可能是脱镁叶绿酸a单加氧酶（PaO）途径的上调基因，通过促进PaO活性来加速叶绿素的降解。Yamatani等［45]从碳离子束辐射的水稻突变种群中筛选分离出叶绿素分解缺陷突变体nyc4-1，基因易位产生突变表型，NYC4参与叶片衰老过程中叶绿素蛋白质复合物的降解。滞绿突变体由于独特的表型可以延缓作物的叶片衰老从而提高作物产量，具有较高的研究价值。

图4 叶绿素降解途径Fig. 4 Chlorophyll degradation pathways

4.2.3 叶绿体的分化发育途径变化 叶绿体是植物进行光合作用主要场所，也是光合色素的主要载体。叶绿体的正常发育有助于植物叶绿素的代谢和积累，叶绿体的分化发育主要受到核-质基因的共同调控，并且核糖体、叶绿体结构蛋白、翻译过程以及mRNA的剪接都会影响叶绿体。质体核糖体蛋白（plastid ribosomal protein, PRP）是早期叶绿体发育的重要组成部分，研究鉴定出的一种热敏叶绿素缺陷突变体tcd11的叶色白化，TCD11编码叶绿体核糖体小亚基蛋白S6，其缺乏大大降低了叶绿体相关基因的转录水平，并在低温下阻止核糖体的组装，对叶绿体发育具有重要的作用［46]。伴侣蛋白60（Cpn60）参与调节许多叶绿体蛋白多肽的折叠，其亚基OsCpn60β1突变体中，光合作用相关途径和核糖体途径受到显著抑制从而影响叶绿体的发育［47]。Wang等［48]从60Co辐射突变池中得到的水稻温敏白化突变体tcd5，叶片在低温（20℃）下白化，高温（32℃）下恢复正常，研究表明编码单加氧酶的TCD5突变基因使其叶绿体的发育受损。对γ射线突变池中分离出的水稻热敏性突变体的研究表明，水稻中核编码的TSV3在冷胁迫下影响叶早期叶绿体的发育［49]。水稻条纹叶色突变体st2（stripe2）表现出叶绿素积累减少和叶绿体异常，分析表明ST2编码一种dCMP脱氨酶，该酶可作为叶绿体发育的新型调节因子［50]。Zhou等［51]发现了60Co辐照下的一种水稻温敏条纹叶色突变体yss1，研究表明YSS8基因中第一个内含子的异常剪切导致YSS1表达降低，第8个内含子保留导致YSS1表达积累。YSS1是水稻幼苗期叶绿体发育必需的质体RNA聚合酶（plastidencoded plastid, PEP）活性的重要调节因子。

4.2.4 其他途径产生的叶色突变 已报道的研究表明，除了常见的叶色突变机制外，植物的一些其他代谢方式、基因突变、信号转导也能够引发叶色突变。植物中的线粒体终止转录因子通过多种机制参与叶绿体和线粒体基因的表达，编码这类家族蛋白的基因发生突变，同样会影响植物叶绿体的发育过程以及叶绿素的合成［52]。γ射线诱变后的突变池中得到的斑点叶突变体spl3，发现其对脱落酸（ABA）不敏感，在含ABA的培养基中根系正常，并且黑暗诱导和自然衰老期间可以延迟叶片黄化，分析表明SPL3可以正向调节ABA响应信号通路，在重要的植物激素信号传导相关过程，如非生物胁迫信号传导、叶片衰老及对病原体的防御之间的互作有重要的作用［53]。Wang等［54]在γ射线突变池中鉴定出的大麦热诱导叶绿素缺陷突变体V-V-Y，遗传分析表明突变性状受单个核基因控制。Li等［55]在60Co辐照水稻突变群中分离出ylc2突变体，幼苗期呈萎黄表型，研究表明定位到的突变基因OsYLC2编码血红素加氧酶2（OsHO2）蛋白，OsHO2可以通过与叶绿体内的四吡咯代谢物和（或）酶相互作用来调节四吡咯生物合成来影响叶绿素的生物积累。

5 总结与展望

植物叶色突变的性状直观明显、便于观察鉴别，并且是与光合作用直接相关的，对植物生理学研究、叶绿素的代谢途径、叶绿体的发育与功能、功能基因组学研究及蛋白质组学等研究都是良好的种质资源。叶色突变体也可以作为标记性状提高杂交制种纯度，缩短育种年限，促进育种进程和提高种质资源利用效率。除此以外，叶色突变体也被直接用于观赏植物新品种的培育［56]，为景观构建提供丰富的材料。辐射诱变由于突变率高、突变谱广、方向多样性、诱发的突变稳定、周期相对较短等优点被广泛用于作物改良育种。辐射诱变源、辐射材料与剂量的选择会直接或间接影响突变效果，根据试验的目的选择适宜的方案是获得突变体的关键。目前，对主要农作物的辐射诱发叶色突变研究较多，而对观赏植物、果蔬等的叶色突变的研究相对较少，相信随着辐射诱变技术的不断发展，对植物叶色突变机制的研究会越来越深入，叶色突变体的应用亦将越来越广泛。