GRB2 rs8082005、RXRA rs3849222位点与延边地区EOPE易感性的关系

蔡宛轩,刘 霞,金 光,董春玉,杨恩月

子痫前期(preeclampsia,PE)影响全球2%～8%的孕妇,是孕妇围产期死亡的主要危险因素之一,对母婴健康有着极大威胁[1-3]。PE以34周作为基本界限,分为早发型子痫前期(early-onset preeclampsia,EOPE)和迟发型子痫前期(late-onset preeclampsia, LOPE)。明确EOPE的发病机制对开展疾病的早期预防和干预至关重要。遗传因素在EOPE的发病中影响重大。寻找并确定PE的遗传易感基因,对了解疾病发病机制以及更好地开展疾病的预防与干预工作至关重要[4]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)一方面是遗传标志物,另一方面还会显著影响到易感性及预后。

生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,GRB2), 通过调控受体酪氨酸激酶(receptor yrosine kinase,RTK)信号通路来调节众多细胞的功能[3]。相关报道指出,RXRA实际位于ADIPO通路,人RXRA的实际位置则是染色体9q34.3,其为RXR的重要成员[5-7]。

1 材料与方法

1.1 病例资料本实验选择延边地区居住10年以上,且2015年3月开始在延边大学附属医院和延边妇幼保健院住院部诊断为EOPE、无其他疾病的382例患者中随机选取192例作为实验组;此外,随机选取同期在延边大学附属医院和延边妇幼保健院自然分娩的192例健康人群作为对照组。所有受试者均签署知情同意书。本研究已通过伦理审查。审批文书号:YB.No20180823。

1.2 SNP的选择通过Regulome-DB数据库、NCBI-SNP数据库(MAF>10、LD值:r2<0.8)、Hapmap-SNP数据库筛选与EOPE相关的28个基因和134个Regulome-SNP位点。经统计分析,28个基因和134个Regulome-SNP位点中GRB2rs8082005、RXRArs3849222位点差异有统计学意义(P<0.05)。

1.3 血样收集及DNA提取、测序收集患者和健康人清晨的空腹外周血液至枸缘酸钠抗凝剂试管,并在-20 ℃低温冰柜(青岛海尔集团)储存备用。提取DNA时按照全血DNA提取试剂盒(日本KURABO公司)说明书通过全血核酸提取仪Quick Gene-810(日本KURABO公司),采用分光光度计Nano Drop-2000(美国伯腾仪器有限公司)测定DNA样本的浓度及污染度。合格标准:浓度>20 ng/μl,A260/A280:1.65～1.85。将合格的DNA样本送到北京华大基因公司进行以MassARRAY SNPS质谱为基础的基因分型。

1.4 PCR-RFLP与基因分型运用相应的引物设计软件,以及对应的Primer Premier 5.0,进而完成相关引物。设计引物原则为:将聚合酶链式反应扩增范围控制在150～300 bp并且不能含有自身互补序列避免产生引物二聚体;发卡结构以及G+C含量应在40%～60%之间(表1)。依靠查询软件来寻求适宜的限制性内切酶,来实现酶切断的效果(表2)。采用Sequenom MassARRAY®质谱的基因分型法及PCR-RFLP,开展相应的基因分型操作。

表1 位点PCR扩增引物序列及条件

表2 限制性内切酶设计

1.5 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行统计分析,数据资料采用χ2检验分析,验证资料是否匹配采用相应的H-W平衡律,P>0.05说明群体代表性和可比性;运用t检验方法,对比病例组、对照组的年龄(P>0.05)差异;运用Logistic回归分析对比病例、对照组的基因型方面的区别,运用TYPER 4.0软件分析样本波峰图。

2 结果

2.1 rs3849222、rs8082005 SNP分型峰值图检测样本为RXRArs3849222 CC型,则只有C碱基对应分子量位置有峰,而T碱基对应分子量处无峰。见图1。检测样本为RXRArs3849222 TC型,则T碱基对应分子量位置有峰,C碱基对应分子量位置也有峰。见图2。测样本为RXRArs3849222 TT型,则只有T碱基对应分子量位置有峰,而C碱基对应分子量处无峰。见图3。检测样本为GRB2rs8082005 CC型,则只有C碱基对应分子量位置有峰,而T碱基对应分子量处无峰。见图4。检测样本为GRB2rs8082005 TC型,则T碱基对应分子量位置有峰,C碱基对应分子量位置也有峰。见图5。测样本为GRB2rs8082005 TT型,则只有T碱基对应分子量位置有峰,而C碱基对应分子量处无峰。见图6。

图1 RXRA rs3849222 CC基因型

图2 RXRA rs3849222 TC基因型峰值图

图3 RXRA rs3849222 TT基因型峰值图

图4 GRB2 rs8082005 CC基因型峰值图

图5 GRB2 rs8082005 TC基因型峰值图

图6 GRB2 rs8082005 TT基因型峰值图

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验本研究纳入患者及正常对照组各192例,经拟合优度χ2检验分析表明纳入研究对象的基因型分布频率均符合哈迪-温伯格遗传平衡检验(χ2=0.613,P=0.456),提示所研究位点符合在人群中的分布规律,说明实验组和对照组所选的研究对象来自同一孟德尔群体,具有群体代表性和可比性。

2.3 两组基本资料的比较本实验中共选择实验组女性192例(100%),对照组女性192例(100%)。经t检验分析,两组在年龄分布比例差异没有统计学意义。

2.4 多态性与易感性的关系实验组中GRB2rs8082005 TT、TC、CC基因型分别占比43.8%(84/192)、50.0%(96/192)、6.2%(12/192),对照组中GRB2rs8082005 TT、TC、CC基因型分别占比37.0%(71/192)、46.4%(89/192)、16.6%(32/192)。经非条件Logistic回归分析,与携带TT、TC基因型患者相比,携带CC基因型患者更易罹患EOPE(OR=3.155,95%CI=1.513～6.579,P=0.002);在隐性模型中,相比于TT+TC基因型携带者,携带CC基因型患者EOPE发病风险增加(OR=3.000,95%CI=1.495～6.022,P=0.002)。实验组中RXRArs3849222TT、CT、CC基因型分别占比9.9%(19/192)、54.7%(105/192)、35.4(68/192),对照组中rs3849222 TT、CT、CC基因型分别占比21.9%(42/192)、39.6%(76/192)、38.5(74/192)。经非条件Logistic回归分析,与携带CC基因型患者相比,携带TT基因型患者更易罹患EOPE(OR=2.031,95%CI=1.077～3.820,P=0.028);在隐形模型中,相比于携带CC+TC基因型患者,携带TT基因型患者增加EOPE发病风险(OR=2.549,95%CI=1.421～4.573,P=0.002)。综上所述,通过Logistic回归分析证实了SNPs携带(GRB2rs8082005 CC或RXRArs3849222 TT)更容易罹患EOPE,见表3。

表3 GRB2 rs8082005、RXRA rs3849222基因型频率分布

2.5 基因多态性对携带不同基因型患者发生EOPE的影响在联合基因型分析中,GRB2rs8082005 CC、RXRArs3849222 TT基因型为危险基因型,所以每个个体的危险基因型数在0到2之间(0、1、2),最终得出,与危险基因数0个相比,携带危险基因数1个和携带危险基因数2个差异具备统计价值(P<0.001)。危险基因型数量与EOPE的发病率呈正相关,携带1个或2个危险基因型的患者较不携带危险基因型患者更容易患病EOPE。(调整OR=2.779,95%CI=1.665～4.639,P<0.001;调整OR=5.175,95%CI=1.080～24.794,P=0.04)。见表4。

表4 危险基因型个数与EOPE易感性的统计分析

3 讨论

早发型子痫前期是所有子痫前期病例中最严重的临床类型,占所有子痫前期病例的 5%～20%,并且与新生儿的发病率和病死率有关[8],它的病情进展快,存在不可预测性,危害高于LOPE[9-10]。如McGinnis et al[11]报告,全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS),鉴定SNP与子痫前期有显著相关性深入分析其发病原理,寻找高效的预防方法,设计对应的治疗措施,必然会成为病症的研究热点。EOPE发生可能与多个基因参与有关,而遗传因素在该疾病的发生过程中扮演着重要角色。

GRB2作为衔接蛋白,与体内多种酪氨酸激酶依赖性信号通路有关,因为独特的自身结构,在多种肿瘤细胞中均有表达,又与胃癌、结肠癌、肝癌的迁移侵袭力相关[12]。王亚楠[13]发现,GRB2基因rs9907177(C>T)位点的单核苷酸多态性与妊娠期高血压疾病存在易感性,携带GRB2rs9907177(C>T)CT和TT组合的基因型人群患HDP的风险高于携带CC基因型人群。本论文也研究分析GRB2,结果表明GRB2rs8082005携带C等位基因较TT+TC基因型患者增加患EOPE风险。本课题组曾研究过GRB2的SNP,结果可能由于铂类药物作用于GRB2rs1044228位点,影响GRB2复合物介导相关的EGFR等信号通路,导致携带GRB2rs1044228CC基因型非小细胞肺癌患者生存期更长。

ADIPOQ属于内皮保护因子,能够增加胰岛素敏感性、减少心血管疾病、抑制巨噬细胞的活性及炎症因子TNF-α的表达,具有良好的抗炎作用,能有效地抑制内皮细胞产生生物活性因子[14]。血管内皮损伤是EOPE发病的主要环节,TNF-α可促进其他因子损伤内皮细胞,从而降低内皮细胞NO的分泌及增加内皮素的释放,使许多脏器功能严重受损,导致EOPE的发病[15]。EOPE孕妇血清ADIPOQ水平明显降低,且其病情越重,ADIPOQ水平降低越明显,可能与ADIPOQ水平下降所致抗炎、抗氧化能力不足、滋养层细胞浸润障碍加剧、血管内皮功能下降、NO合成不足等机制有关[16]。由于RXRA位于ADIPO通路,会受到影响。因此该研究分析了RXRArs3849222位点与延边地区孕妇EOPE易感性关系,结果表明RXRArs3849222位点SNP与延边地区孕妇患EOPE风险存在明显相关性,且携带T和CC+TC等位基因相比携带C等位基因型患者增加患EOPE风险。

综上所述,GRB2rs8082005(C>T)、RXRArs3849222(T>C)可能是EOPE的易感因素,影响妊娠期高血压的发生。由于EOPE是由遗传因素导致的妊娠期疾病,受多个基因、位点的调控,且环境、饮食、生活方式等也会对其发生发展产生影响[17]。该研究有一些局限性,如研究样本选择来自吉林省延边朝鲜族自治州,这可能造成了选择偏倚并影响了结果。后续研究中,可联合多地区、多民族收集样本进一步研究RXRA、GRB2基因多态性与疾病的关系,明确是否存在地域影响。