儿童言语语言障碍与维生素D受体基因多态性的关系

张延赤,王 旭,吴秀丽,袁久彤,马英伟,王利武,李明辉,高福红,李丹丹,张 远,孙利伟

(长春市儿童医院,吉林 长春130061)

言语语言障碍(speech and languge disorders,SLD)是儿童时期常见的发育障碍性疾病之一[1]。言语是指人们经口发声表达思维活动和意愿的语言实践;语言是人类社会共同使用的代码,同思维有密切的联系,是人类形成和表达思想的手段,也是人类社会最基本的信息载体。言语障碍指言语发育偏离正常顺序,出现语言感受、表达或应用困难[2]。儿童中有3%～6%存在语言障碍[3]。SLD 给社会、家庭和个人造成极大的精神和经济负担;倍受社会和家长的关注。近年有关维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)对神经精神疾病关联的报道较多[4-6],但是,VDR基因SNP多态性与儿童SLD 的关系罕见报道。本文对来我院就诊的488例SLD儿童进行VDR FokI (rs2228570)、BsmI(rs 1544410)、 ApaI(rs 7975232)和TaqI(rs 731236)单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNPs)检测和分析;并与健康体检儿童进行对照。

1 对象与方法

1.1 研究对象及标本采集

观察组为2021年7月—12月在我院康复科、心理科和神经内科以SLD就诊的488例儿童。康复科、心理科采集口腔颊粘膜脱落细胞;神经内科患儿留取末梢血标本。对照组为同期来院健康体检儿童,在向患儿家长告知,取得家长同意并签署知情同意书后留取口腔颊粘膜脱落细胞标本。

1.1.1纳入标准 ①语言发育迟缓,儿童语言发育遵循正常顺序,未达到与其年龄相应的水平,表现为年幼儿童的语言特征。包括智力发育迟缓、特发性语言障碍、行为障碍和环境因素。②语言障碍,语言发育偏离了正常顺序,存在表达性语言、感受性语言或应用性语言方面的困难。

1.1.2排除标准 ①重度精神发育迟滞;②脑外伤、脑肿瘤等获得性SLD。

1.2 研究方法

1.2.1基因组DNA提取 口腔脱落细胞拭子DNA 提取,应用 Tiangen Biotech 公司微量样品基因组DNA提取试剂盒,按试剂说明书提取棉拭子样本基因组DNA;血液样本,应用Tiangen Biotech公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,按说明书提取血清样本基因组DNA。

1.2.2SNP 位点选择 在PubMed中检索VDR基因多态性位点的文献,应用haploview软件检索VDR常见基因标签,并且考虑功能位置的基因,在VDR基因外显子和内含子区各选取2个基因标签,分别为外显子区Fok I(rs2228570)和Taq I(rs731236;内含子区Bsm I(rs1544410)和Apa I(rs7975232)。多态性位点信息及引物序列见表1。

表1 言语语言障碍伴随其他临床诊断(例数)

1.2.3聚合酶连反应(PCR) DNA 扩增试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司产品。反应体系包括:2 × Phanta Max Master Mix 12.5 μl,上下游引物[Forward Primer、Reverse Primer(10 μM)]各1 μl,模板(Template)1 μl,加超纯水(ddH2O)补足25 μl。反应条件:95℃预变性3 min;95℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸15sec,共计35个循环;72℃保温5 min。扩增产物大小分别为:675 bp、608 bp、405 bp和608 bp。

1.2.4PCR扩增产物回收 PCR扩增产物,经1.5%琼脂糖凝胶电泳;电泳目的条带用美国Omega Bio-tek公司核酸纯化试剂盒(Gel Extracttion Kit)回收正确的PCR产物。

1.2.5测序 委托吉林省库美公司完成。应用PCR扩增的上游引物,在ABI 3730XL测序仪进行测序分析。

1.3 统计分析

应用SPSS25.0软件进行统计分析。计数资料进行卡方检验,计量资料进行t检验。应用卡方检验分析VDR SNP位点基因型、等位基因频率,P<0.05为差异有统计学意义。应用卡方检验分析判断哈迪温伯格(Hardy-Weinberg,H-W)平衡;P>0.05为H-W平衡。

2 结果

2.1 一般状况

本文观察组纳入488例SLD患儿,其中男性346例,女性142例,男女之比为2.44∶1。健康对照116,男性56例,女性60例,男女之比为1∶1.07。观察组男性明显多于女性,存在明显差异,经卡方检验有统计学意义(χ2=23.387,P=0.000)。观察组平均年龄为(63.14±37.57)月龄,对照组年龄为(61.09±30.69)月龄,两组比较年龄无明显差异(t=0.539,P=0.590)。观察组和对照组VDR基因多态性基因型、等位基因频率均符合Hardy-Weinbeig平衡,卡方检验P>0.05。

2.2 临床诊断

488例患儿均表现为SLD。临床诊断语言发育迟缓84例(17.21%),特发性SLD 228例(46.72%);240例(49.18%)患儿SLD伴有其他疾病,具体临床诊断见表1。

2.3 VDR 基因多态性SNP分布

2.3.1VDR基因BsmI、ApaI 、TaqI和FokI区,rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位点SNP多态性,PCR产物测序,核酸序列峰图,见图1。

图1 VDR SNP测序峰图

2.3.2VDR基因及等位基因频率 488例SLD患儿BsmI、ApaI 、TaqI和FokI区,rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位点SNP多态性分布,基因型分布,见表2;等位基因分布,见表3。观察组和对照组比较ApaI和FokI区rs 7975232和rs2228570位点基因型和等位基因分布存在明显差异;BsmI和TaqI区rs 1544410和rs 731236位点基因型和等位基因分布无差异。

表2 VDR基因rs7975232、rs2228570、rs1544410和rs731236位点基因型分布(例数)

表3 VDR基因rs 7975232、rs 2228570、rs 1544410和rs731236位点等位基因分布(例数)

2.3.3不同SLD VDR基因rs 7975232和rs2228570位点SNP分布 将488例观察组按疾病种类分4组,观察组1为单纯语言发育落后,患儿20例;观察组2为特发性SLD组,患儿228例;观察组3为心理障碍伴SLD,患儿114例;观察组4为神经系统疾病伴SLD,患儿126例。4组患儿ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)基因型及等位基因频率见表4、表5。ApaI(rs 7975232)基因型,与对照组比较,观察组1无差异;其他3组存在明显差异;FokI(rs2228570)基因型,与对照组比较,4个观察组均存在明显差异。ApaI(rs 7975232)等位基因分布,与对照组比较,观察组3存在明显差异;FokI(rs2228570)等位基因分布,与对照组比较,观察组1-4均存在差异,经卡方检验有统计学意义。

表4 VDR基因ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)位点基因型分布(例数)

表5 VDR基因ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)位点等位基因分布(例数)

2.4 VDR基因多态性与SLD的相关性

2.4.1ApaI(rs 7975232)多态性与SLD的相关性 在ApaI区rs 7975232位点基因型GA较GG/AA发生SLD的风险高,OR=2.246,95% CI(1.440～3.502)。G等位基因发生SLD的风险高,OR=1.461,95% CI(1.027～2.078)。

2.4.2FokI(rs2228570)多态性与SLD的相关性 在FokI区,rs2228570位点,基因型GA较GG/AA发生SLD的风险高,OR=3.068,95% CI为(1.968～4.785)。G等位基因发生SLD的风险高,OR=1.649,95% CI为(1.234～2.204)。

3 讨论

语言是人类高级神经系统活动的一种形式,儿童自出生起便开始学习语言,语言发展的历程是非常复杂的过程。语言发育影响因素包括:遗传学因素、语言学因素、生理学因素、社会学因素。语言在人们认知社会和发挥社会功能中具有重要作用。SLD是遗传与环境交互作用的结果,具有复杂遗传模式的多因素起源[7]。

近年,大量的研究证实VDR基因多态性与疾病的发生发展密切相关[8-10]。VDR为亲核蛋白,在神经元细胞和神经胶质细胞中有较多表达,属于超家族成员。VDR 经配体 1α,25(OH)2D3 激活后发挥核受体作用[11]。维生素D的许多生物学功能都是通过VDR介导调节靶基因转录来实现。研究发现:维生素D在大脑发育、神经传递、神经保护和免疫调节中起着关键作用;VDR存在于发育中和成年的大脑中,介导维生素D对大脑发育和功能的影响[12]。动物实验发现VDR在胚胎第12天就在大脑中出现,第15天到第23天,VDR蛋白和mRNA的表达普遍增加,并且在大脑各个区域广泛分布[13]。提示VDR在脑发育和语言发育中起重要作用。本文首次对SLD患儿VDR基因SNP多态性进行检测及分析,探讨发生SLD的遗传因素,为有效预防SLD提供科学依据。

VDR的变异可能在每个人群所发挥的作用不同,VDR这些多态性可能影响其活性和功能。本研究对488例SLD患儿检测并分析VDR基因BsmI、ApaI 、TaqI和FokI区,rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位点SNP多态性。发现ApaI(rs 7975232,G→A)和FokI(rs2228570,A→G)与SLD发生相关;rs 7975232 G/A基因型,rs2228570 A/G 基因型发生SLD风险高;rs 7975232 G和rs2228570 G等位基因是发生SLD的危险因素;BsmI区rs 1544410位点和TaqI区rs 7975232位点与SLD无关。Can MS等研究发现Fok I 多态性与抑郁症发生无相关性[14]。Taq I 位点的 T 等位基因以及 Apa I 位点的 a 等位基因与自闭症发生率降低相关[15]。

国内外研究均显示SLD的发病率存在性别差异。本研究男性明显多于女性,男女之比为2.44∶1。瑞典Schachinger-Lorentzon U的相关研究,男女之比为2∶1[7],周浩相关研究男女之比为4.42∶1[1]。提示人们对于男性婴幼儿,应加强言语交流,注重语言发育情况,及时发现问题及时进行相应的检查和治疗。

儿童SLD种类多,发生原因复杂。早期明确病因,及时有效干预,对于早期治愈和改善预后有积极意义。本文语言发育迟缓17.21%(84/488),特发性SLD 46.72%(228/488);接近陈炜报道特发性SLD比率46.90%[16],低于周浩报道的54.37%[1]。智力发育落后或障碍4.92%(24/488);本研究心理疾病伴SLD 占比为23.36%(114/488),神经系统疾病伴SLD患儿占比为25.82%(126/488)。对于以SLD就诊的儿童首先要明确病因,根据病因进行相应的治疗,可避免贻误病情,取得最佳疗效和改善预后。