血浆Septin9基因甲基化检测对结直肠癌诊断的价值研究

陆飞燕,陆相磊,岑小宁,黄春程,黄林达,龙喜带,3,4,朱晓莹,3,4

(1.右江民族医学院附属医院临床病理诊断与研究中心,广西 百色 533000;2.右江民族医学院附属医院胃肠外科,广西 百色 533000;3.广西肝胆疾病分子病理学重点实验室,广西 百色 533000;4.广西高校肿瘤分子病理学重点实验室,广西 百色 533000)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一,据统计报告显示[1]:CRC发病率位居所有恶性肿瘤中的第2位,死亡率位居第4位,对人类健康具有很大威胁。医疗技术的发展为患者带来福音,早期CRC患者生存质量和生存期得到明显改善。但由于CRC早期症状不典型,绝大多数患者就诊时疾病已经进展至中晚期而错过最佳治疗时期。据报道[2-3],早期CRC患者5年生存率可达90%,而进展期仅为10%。因此,早期筛查诊断是CRC患者早期治疗、获得较好治疗效果的关键。

以往的CRC筛查主要有结直肠镜检查、大便隐血试验(FOBT)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)检测等,肠镜是一种侵入性检查,结直肠镜筛查依从率较低[4],而后几种检测对CRC诊断的敏感度和特异性相对较低,不能很好地满足临床需求。研究发现Septin9-v2 启动子区的CpG 岛高度甲基化是CRC发生的关键,即Septin9基因甲基化(methylated Septin 9,mSEPT9)的异常表达导致基因转录活性降低,进而影响基因正常的生理功能,最终诱导癌症的发生。mSEPT9随着癌细胞坏死破裂进入到血液循环中可被检测到,为CRC检测提供了基础。我国一项CRC筛查分析报道,拒绝接受结肠镜检查对象中有82.6%愿意接受血浆mSEPT9检查[5]。相对于以往的CRC筛查方法,血浆Septin9基因甲基化检测具有简单易行、无创的优势,本研究通过检测血浆mSEPT9结果对CRC的诊断价值,辅助临床开展CRC相关诊疗工作。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2020年5月至2022年4月在右江民族医学院附属医院收治并进行病理学诊断为非CRC患者42例和CRC患者129例,分别作为非CRC组和CRC组。纳入标准:参照《中国临床肿瘤学会(ESCO)CRC诊疗指南 (2019版)》综合诊断为CRC的患者。排除标准:既往其他肿瘤病史,已接受放化疗、手术治疗或全身治疗,合并严重心血管疾病者,妊娠期、哺乳期妇女,临床资料不完整等。本次研究入选患者171例,男性105例,女性66例,年龄28～82岁,平均年龄(57.46±12.50)岁。171例患者均接受血浆mSEPT9检测、FOBT、CEA和CA199检测。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂 血浆Septin9基因甲基化检测试剂盒(北京博尔诚医学检验所有限公司),大便隐血(FOBT)检测试剂盒(胶体金法)(四川沃文特生物技术有限公司)、癌胚抗原(CEA)检测试剂盒[罗氏诊断产品(上海)有限公司]、CA199检测试剂盒[罗氏诊断产品(上海)有限公司]。

1.2.2仪器 实时荧光定量PCR仪(7500fast),轮状旋转混匀器,加热型恒温金属浴,试管架和磁力架,离心机,自动粪便处理分析仪,全自动电化学发光分析仪[罗氏诊断产品(上海)有限公司]等。

1.3方法

1.3.1血浆Septin9基因甲基化检测(PCR荧光探针法) 检测流程按照试剂盒说明书进行。①样本采集和保存:使用EDTA-K2抗凝真空采血管采静脉血10 mL,24 h内室温(1350±150) r/min离心12 min,分离血浆至少3.5 mL,血浆于-20 ℃保存,1周内完成检测;②DNA样本提取和转化:按试剂盒说明书提取血浆DNA并进行亚硫酸盐转化;③配制PCR反应体系:按试剂说明书配制PCR反应体系并加入亚硫酸盐转化后的DNA样本;④PCR反应:利用实时荧光定量PCR仪(7500fast)按试剂盒说明书设置PCR反应程序,进行PCR反应;⑤结果判读:按照试剂盒说明书对结果进行判读。

1.3.2大便隐血试验(FOBT) 粪便标本24 h内检测。使用自动粪便处理分析仪上机检测,结果由本院检验科提供。

1.3.3CEA和CA199检测 及时离心分离血清,24 h内检测。采用化学发光法检测,结果由本院检验科提供。

1.4统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析,计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验,诊断效能采用ROC曲线评价。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组患者年龄和性别分布情况 在171例入选患者中,CRC组129例,其中男性85例,女性44例,男性多于女性(约1.93∶1),年龄28～82岁,平均年龄(56.83±12.94)岁;非CRC组42例,其中男性20例,女性22例,年龄32～78岁,平均年龄(59.38±10.95)岁。

2.2CRC组和非CRC组血浆mSEPT9检测结果 CRC组患者血浆mSEPT9阳性率为58.14%(75/129)。非CRC组mSEPT9阳性率为19.05%(8/42),其中结直肠腺瘤/息肉组mSEPT9阳性率为29.17%(7/24),结直肠无异常组mSEPT9阳性率为5.56%(1/18)。CRC组和非CRC组患者mSEPT9检测结果相比,差异具有统计学意义(P<0.001),结直肠腺瘤/息肉组与结直肠无异常组mSEPT9检测结果相比,差异无统计学意义(P=0.126)。mSEPT9检测结果在年龄、性别上差异无统计学意义,见表1。

2.3mSEPT9、FOBT、CEA、CA199及mSEPT9联合检测在CRC诊断中的应用价值比较 单项检测中,mSEPT9检测在CRC诊断中的敏感度和阴性预测值高于CEA和CA199;特异度和阳性预测值高于FOBT。血浆mSEPT9检测联合FOBT检测敏感度高达96.12%,明显高于两者单项检测,但特异度较两者单项检测有所降低。mSEPT9检测联合CEA敏感度明显高于两者单项检测,但特异度与单项mSEPT9检测特异度相当,较CEA检测特异度(100%)有所降低。mSEPT9检测联合CA199敏感为63.57%,高于两者单项检测,但特异度低于单项检测。mSEPT9、FOBT、CEA和CA199四项联合检测敏感度达96.90%。从ROC曲线来看,mSEPT9检测、FOBT、CEA检测AUC值分别为0.695、0.688、0.698,显示对CRC的诊断准确性较好(P<0.001),而CA199的AUC为0.573(P=0.155)。基于mSEPT9的联合检测中,mSEPT9联合CEA使得AUC(0.746)高于两者单项检测(0.695,0.698),其他联合检测并不比单项mSEPT9有更好地提升。见表2、图1。

图1 不同检测方法诊断CRC的ROC曲线

表2 不同检测方法在CRC诊断中的应用价值

3 讨论

CRC是常见的消化系统恶性肿瘤之一,全球范围内,CRC发病率呈现不同程度的增加趋势,在肿瘤致死原因中位居第二[6]。随着饮食方式西方化、运动量减少等原因,我国CRC新发病例依然上升,2018年我国CRC的新发病例超过37.6万例,死亡数达19.1万例[7],而早期对CRC患者进行筛查并及时治疗对于提高患者5年生存率具有重要意义。CRC的发生发展与其他恶性肿瘤一样是一个复杂的过程,其具体机制目前尚未完全清楚。Septin基因组广泛存在于真核生物中,参与细胞质分裂、细胞极化、囊泡运输和细胞膜重构等多个生物过程[8]。Septin9蛋白能调控细胞生长,防止细胞分裂过快或不受控制的增殖,是抑癌基因家族成员之一。而Septin9-v2 启动子区的CpG 岛高度甲基化而引起自身表达异常,可诱导癌症的发生。本研究结果显示,CRC组血浆mSEPT9检测阳性率高于非CRC组,两组患者血浆mSEPT9检测结果差异具有统计学意义,表明Septin9基因甲基化与CRC的发生密切相关,血浆mSEPT9检测对CRC的诊断具有重要参考意义。同时发现,血浆mSEPT9检测结果与患者年龄、性别及肿瘤的位置无关,与SONG L L等[9]和陈培等[10]研究结果相一致,提示该检测方法可能不与这些临床特征相关,而适用于更多的患者。

传统的CRC检测方法包括FOBT、CEA、CA199等,本研究将血浆mSEPT9检测与几种传统检测方式结果进行对比,发现血浆mSEPT9检测敏感性和阴性预测值均高于CEA和CA199,与堵一乔等[11]和宫晓红等[12]结果相一致;特异度和阳性预测值高于FOBT。虽然FOBT敏感性最高,但由于引起大便隐血阳性的因素很多,导致特异度不够,而CEA和CA199虽然特异度高,但敏感度较低。综合来看,单项检测中血浆mSEPT9检测敏感性和特异度均较高,且优于单项FOBT、CEA和CA199检测,对CRC具有较好的检测效能。另外,研究结果显示血浆mSEPT9分别与FOBT、CEA和CA199联合检测时敏感度均明显高于两者单项检测,血浆mSEPT9、FOBT、CEA和CA199四项联合检测敏感度达96.90%,表明基于血浆mSEPT9检测的联合检测对CRC筛查诊断具有更高的参考价值。本研究联合检测结果特异度与李娜等[13]结果有一定差异,可能是因为样本数量、样本自身、样本采集和运送条件等原因有关。由于确定 mSEPT9阳性的方法有1/1、1/2、1/3和2/3等不同算法,如1/3算法表示:3次PCR重复实验应出现至少1次阳性则判断为阳性。根据临床实际,临床样本很难多次重复检测,不同的计算方法可能会得出不同的结果,实验中使用哪种算法目前没有达成标准,需要进一步研究探索。除了血清肿瘤标志物检测,目前已有报道mSEPT9、SDC2、TFPI2基因甲基化联合筛查CRC的研究[14-15],显示多基因联合检测可提高检测敏感度,同时为癌前病变检测提供一定应用依据。但联合哪几种分子检测效能最佳,是否可作为诊断金标准等问题尚需要更多研究和数据支持。综上所述,基于血浆mSEPT9的联合检测能够提高检测敏感度,可能更好地满足临床筛查CRC的需要,同时提示临床可根据患者情况,采取适合的联合检测项目,以提高检出率。

本研究存在一些不足之处,由于资料局限性,尚未分析mSEPT9检测结果与CRC患者临床分期、转移情况关系,未开展患者治疗前后血浆mSEPT9水平变化关系和复发监测等研究。随着基因甲基化相关治疗的研究进展,mSEPT9有望成为CRC治疗靶点之一,这些都值得进一步探索。血浆mSEPT9作为一种简单无创、敏感度和特异度较高的检测方法,联合检测能够一定程度上提高敏感性,对于CRC的筛查诊断有重要意义。应积极做好CRC防治宣传,预防为主,同时提高筛查依从性,探究检测项目提高检测效能,通过早发现早治疗提高患者生存质量。