铁死亡机制与蓝光引发小鼠视网膜光损伤病理变化的联系

任铭心,黄宗亮,梁宇,刘俊杰,王剑锋

(1.蚌埠医学院临床医学院,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠医学院第一附属医院,安徽 蚌埠 233000)

超过视网膜耐受限度的光照会引发一定的视网膜损伤,早在1966年NOELL W K等[1]已经通过对大鼠光照的动物实验证实了光会损伤视网膜。在光照引发的视网膜光损伤的3种方式中光化学损伤最普遍。铁死亡(ferroptosis)是一种新发现的调节性细胞死亡,其显著特征为脂质过氧化发生和铁积累[2]。蓝光是波长在400～500 nm之间的一部分可见光,它波长较短,具有较高的能量,可穿透晶状体直达视网膜。过度暴露在蓝光下会导致光感受器的损失、脂质过氧化和细胞凋亡,这提示在蓝光引导的视网膜光损伤中可能有铁死亡的参与[3-4]。除此之外,视网膜光损伤与年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)两种眼科最为常见的视网膜退行性疾病的发生率以及疾病进展过程密切相关[5-6],其具体机制尚不清楚。因此,本研究通过蓝光光照构建小鼠视网膜光损伤模型与生物信息学方法探究铁死亡机制与蓝光引发小鼠视网膜光损伤病理变化的联系,为上述类型疾病的临床治疗提供可能的理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 40只5～6周龄健康雄性C37小鼠,购自于合肥庐阳区义东生物用品经营部,小鼠饲养于安徽省立医院动物实验中心动物房内。动物房内通风良好,温度范围为20 ℃～25 ℃,相对湿度50%～60%,屏障环境等级为SPF级。小鼠使用标准饲料喂养,自由饮水进食,鼠房内照明光源为LED日光灯,光照强度为(400±20) lux,昼夜明暗交替节律设定为12 h∶12 h。全部小鼠在适应性饲养7 d后方开始实验。

1.2主要试剂与仪器 丙二醛(MDA)测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、4%多聚甲醛组织固定液、磷酸盐缓冲液(0.01M,PBS)、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司,货号:AB112);蓝光光照箱(自制)、暗适应箱(自制)、酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司,Muitiskan MK3)、光学显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司,OLYMPUS CX43]、光照度计(标智GM1010)、石蜡切片机(LEICA BIOCUT)、组织包埋机(LEICA Arcadia H+C)、472 nm LED蓝光灯带(11.52W/M 深圳市纳图照明科技有限公司)。

1.3动物分组与光损伤模型的制备

1.3.1动物分组 将40只小鼠按照随机数表法分为4组(n=10):正常对照组、标准强度时长组、长时长组、强光照组。

1.3.2光损伤模型的制备 自制1种暗适应箱,3种蓝光光损伤箱,箱体大小为70 cm×50 cm×50 cm,箱体材质不透光。将LED蓝光灯带固定至光损伤箱箱体各面,使光损伤箱各方向光照强度基本相同,暗适应箱不安装LED蓝光灯带。3种光损伤箱的蓝光灯带总长度和总面积不完全相同,使其中两种使用光照度计(标智GM1010)测量箱内平均光照强度为(800±50) lux,另外一种为(2 000±100) lux。所有实验小鼠在自制暗适应箱内暗适应24 h后进行实验。正常对照组小鼠仍在鼠房正常日光灯光照环境下饲养,光强度为(400±20) lux,照射时长设定为6 h/d。标准强度时长组小鼠放入光照强度为(800±50) lux的光损伤箱内,照射时长设定为6 h/d,总蓝光光照时长为42 h。长时长组小鼠的光损伤箱平均光照强度为(800±50) lux,但照射时长设定为9 h/d,即总蓝光光照时长为63 h。强光照组小鼠则使用平均光照强度为(2 000±100) lux的光照箱,蓝光光照时长为6 h/d,总光照时长42 h。所有小鼠光照完成后均放入自制不透光暗适应箱,在暗适应下小鼠瞳孔会发生散大,有利于光损伤进一步发生。

1.4指标测定与方法

1.4.1小鼠血清内MDA含量的测定 将规格为0.45 mm×100 mm的毛细管进行抗凝处理后对所有小鼠施行眼眶后静脉丛采血,采血前在小鼠眼眶周围注射局部麻醉剂麻醉。所取血液使用低温台式离心机进行离心,温度设定为4 ℃,转速设定为10 000 r/min,时间设定为10 min。离心完成后取血清,使用TBA法对小鼠血清内MDA含量进行测定。所有操作步骤均按照试剂盒说明书严格执行。

1.4.2视网膜标本制备与形态学 观察颈椎脱臼法处死小鼠后,取小鼠另一侧未施行采血操作眼球,放置于4%多聚甲醛溶液中固定20 min,随后于PBS液浸泡环境中在显微镜下用角膜剪沿角巩膜缘处剪开,去除小鼠眼玻璃体,用镊子剥离出完整视网膜。剥离下的视网膜组织平铺于培养皿中,平铺过程中注意将视网膜尽量展平。加入4%多聚甲醛溶液至浸没视网膜,盖紧培养皿后置于4 ℃恒温冰箱中过夜[7]。第2天脱水透明,完成后用透明石蜡沿矢状位水平包埋组织。对石蜡进行切片,切片厚度设定为5 μm。烤片30 min后进行HE染色并脱水封片,40×10倍光学显微镜下观察拍摄。运用CaseViewer观察视网膜细胞形态并测量数据。

1.4.3免疫组织化学检测 用于检测Bcl-2表达的石蜡切片于58 ℃烤箱中烘片脱蜡至水化,PBS液冲洗3次×3 min。每张切片加入3%H2O2孵育10 min,以阻断内源性过氧化物酶活性,孵育完成后用PBS液冲洗。去除PBS液后以Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体为一抗4 ℃孵育过夜,二抗37 ℃孵育1.5 h,PBS洗3×3 min。DAB显色3～5 min,苏木素复染,中性树胶封片镜检。光镜下观察拍照,应用ImageJ软件比较Bcl-2蛋白表达变化。

1.6视网膜光损伤中铁死亡潜在靶点筛选与分析 FerrDb[8]数据库获取铁死亡相关基因,GeneCards[9]数据库获取视网膜光损伤相关基因。绘制Venn图筛选视网膜光损伤中铁死亡潜在靶点,使用DAVID[10]数据库对筛选出基因进行GO与KEGG富集分析,选取GO富集分析前10位条目与KEGG富集分析前20条通路绘制条形图与气泡图。

2 结果

2.1MDA含量检测结果 与正常对照组相比,接受LED蓝光灯带照射的小鼠血清内的脂质氧化产物MDA含量均有显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与标准强度时长组相比,长时长组、强光照组小鼠的血清MDA含量也有着显著的增加,差异有统计学意义(P<0.05)。强光照组小鼠血清中MDA的含量比长时长组小鼠同样显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),见表1、图1。

注:与正常对照组比较,a:P<0.05;与标准强度时长组比较,b:P<0.05;与长时长组比较,c:P<0.05。

表1 各组小鼠血清中MDA含量

2.2MDA预测视网膜光损伤的ROC曲线 MDA对于视网膜光损伤具有较高的预测价值(P<0.05),其曲线下面积(AUC)为0.990(95%CI:0.968～1.000),最佳截断值为16.46 μmol/L,见图2。

图2 MDA预测小鼠视网膜光损伤的ROC曲线

2.3视网膜形态学结构变化 正常对照组小鼠的视网膜HE染色结果显示,视网膜的内节和外节细胞排列基本致密和整齐,形态没有明显损伤。内丛状层(inner plexiform layer,IPL)细胞比内核层(inner nuclear layer,INL)细胞层数少,染色比外核层(outer nuclear layer,ONL)细胞浅,厚度较薄,其他各层细胞之间分界线也较为明显。标准强度时长组、长时长组、强光照组小鼠的视网膜各细胞层细胞均出现不同程度的损伤,细胞密度明显下降。部分细胞表现出细胞质嗜酸性变、核固缩、核碎裂、核溶解,其中以INL、ONL细胞较为明显,见图3。将所有取得的小鼠视网膜的总厚度、IPL、INL、ONL、感光细胞层(photoreceptor layer,PRL)厚度数据测量记录后,运用SPSS 26.0软件分析后得出结果。结果显示,3组接受蓝光光照小鼠的视网膜总厚度、IPL、INL、ONL、PRL厚度均比正常对照组小鼠变薄(P<0.05)。与标准强度时长组小鼠相比,长时长组小鼠的视网膜总厚度、INL与ONL厚度较薄(P<0.05),而IPL和PRL厚度没有明显差别。强光照组小鼠的视网膜总厚度和IPL、INL厚度与长时长组相比也变薄(P<0.05),但ONL与PRL厚度没有明显改变,见表2。

注:GCL.神经节细胞层;IPL.内丛状层;INL.内核层;OPL.外丛状层;ONL.外核层;PRL.感光细胞层

表2 不同光照条件组小鼠视网膜及各细胞层厚度统计 单位:μm

2.4免疫组织化学检测结果 Bcl-2阳性表达位于视网膜各层细胞细胞质内,表现为特异性棕黄色细颗粒状染色。正常对照组、标准强度时长组、长时长组、强光照组表达Bcl-2的平均光密度值分别为0.187±0.006、0.148±0.007、0.103±0.006、0.115±0.039。在正常对照组中可见细胞棕黄色浓染,而接受不同程度蓝光照射小鼠的视网膜Bcl-2的表达量均有不同程度降低,细胞棕黄色浓染相对较浅,见图4。

注:A.标准强度时长组;B.长时长组;C.强光照组;D.正常对照组。

2.5潜在基因靶点筛选结果 通过FerrDb数据库获取259个铁死亡基因靶点,GeneCards数据库筛选获取146个视网膜光损伤基因靶点,利用Venny2.1在线工具将铁死亡与视网膜光损伤基因靶点取交集,绘制Venn图,获得17个潜在相关基因靶点,见图5。

图5 铁死亡与视网膜光损伤潜在基因靶点交集Venn图

2.6GO基因功能与KEGG通路富集分析结果 运用DAVID数据库对17个靶点KEGG富集分析后获得80条通路,主要涉及脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、内分泌耐药(endocrine resistance)等。使用自制R包对前20位通路绘制气泡图,见图6。GO富集分析后得到相关条目170条,生物学过程主要涉及凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、活性氧代谢过程的正向调控(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)等。细胞定位主要包括复杂大分子(macromolecular complex)、细胞核(nucleus)等。分子功能主要涉及蛋白质结合(protein binding)、酶结合(enzyme binding)等。使用自制R包对前10位条目绘制柱状图,见图7。

图6 视网膜光损伤中铁死亡潜在基因靶点KEGG通路分析

图7 视网膜光损伤中铁死亡潜在基因靶点GO生物富集分析

3 讨论

在组成可见光的光谱中,蓝光成分对人眼的影响最为明显[11]。蓝光参与的视网膜光损伤机制主要包括氧化应激反应、线粒体凋亡、炎性细胞凋亡、线粒体凋亡和DNA损伤等[12]。本实验采用模拟蓝光灯照射制作SPF级小鼠的光照损伤模型来探究蓝光引发小鼠视网膜光损伤的病理变化和铁死亡脂质过氧化机制。目前学术界没有公认的光损伤模型造模方法,多数学者采用循环及暗适应的方式对实验动物进行处理,一定时间的暗适应被认为可使光损伤更易发生[13]。不同学者使用的光照强度从850～10 000 lux不等,较强的光照强度一般被用来制作视网膜急性光损伤模型[14]。

在本研究中小鼠视网膜光损伤主要表现为总厚度与INL、IPL、ONL、PRL各层厚度减少和细胞损伤与密度降低。在HE染色中,强光照组的小鼠视网膜INL与ONL细胞损伤较严重,但仅增加光照时长时,小鼠视网膜的PRL厚度减少明显。有新证据表明,蓝光的光毒性还通过氧化应激和炎症反应损害眼表[15],这提示不同的光照强度和时间对眼各部位组织的损伤效果和针对性可能不同,对各种视网膜疾病发生的影响也不同。另有研究结果显示,虽然蓝光会对视网膜造成明显光损伤,但其在调节松果体褪黑素的分泌从而介导人类生物钟的生成与调节方面却有重要作用[16-17]。

Bcl-2是一种抑制凋亡基因,其在视网膜光损伤导致的细胞凋亡与维持细胞内各种细胞器的稳定尤其是线粒体中起着重要作用[18]。免疫组织化学方法检测发现,接受蓝光光照的小鼠视网膜细胞中Bcl-2蛋白会不同程度降低,从而导致细胞发生凋亡。这可能是因为视网膜组织中含有丰富的线粒体,线粒体的色素光谱吸收峰值与蓝光类似,在蓝光照射下较易发生自由基和脂质介导的过氧化,而Bcl-2蛋白又主要分布于线粒体膜上所导致的[19]。在光化学Ham损伤中[20],视网膜的损伤与视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium,RPE)细胞中黑色素、脂褐素等的含量变化有紧密联系。以往研究发现,钙和镁等金属离子在糖尿病导致的视网膜细胞凋亡中起重要作用[21],但铁在视网膜的视觉光导级联中同样不可或缺。有研究表示,铁死亡可能在视网膜光感受器(photoreceptor,PR)的不可逆损伤中起到十分重要的作用,而PR的损伤变性是AMD等疾病的显著表现[22]。其中,负责从脉络膜中向PR传递葡萄糖等营养物质的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium cells,RPECs)可能是铁死亡发生的主要细胞[23]。MDA是细胞膜脂质过氧化(lipid peroxidation,LPO)最主要的产物之一,通过小鼠血清内其含量的高低,可判断小鼠视网膜发生铁死亡与脂质过氧化损伤的严重程度。通过ROC曲线可知,将MDA作为预测小鼠视网膜光损伤中铁死亡脂质过氧化发生的指标是十分可靠的。当小鼠血清内MDA含量达到16.46 μmol/L时,认为小鼠视网膜发生铁死亡脂质过氧化的可能性较大。

对筛选出的铁死亡与视网膜光损伤的17个相关基因靶点进行GO与KEGG分析后,发现其生物功能主要涉及凋亡过程的负调控、活性氧代谢过程的正向调控、蛋白质结合、酶结合等。信号通路主要涉及脂质与动脉粥样硬化、内分泌耐药、MAPK信号通路等。其中,凋亡过程的负调控在铁死亡介导的其他疾病如特发性心肌病中被多次提及[24],但在视网膜光损伤中暂未得到深入研究。同时,脂质与动脉粥样硬化被认为是以视网膜光损伤为高危因素的AMD的表现之一[25]。而铁依赖的脂质过氧化显著影响动脉粥样斑块的稳定性,其代谢产物MDA修饰的低密度脂蛋白又可引发相关免疫过程,影响动脉粥样硬化的发展[26]。ZENG S X等[27]发现,将维持视网膜光感受器健康的Müller细胞中的MAPK信号通路抑制后,可以显著缓解Müller细胞胶质增生与视网膜光感受器变性。

综上所述,蓝光可导致小鼠视网膜发生光损伤,使其出现组织形态改变,细胞损伤和凋亡,并且其损伤程度随着蓝光照射的时长和强度的增加而增加。在视网膜光损伤小鼠血清中MDA含量显著上升,提示铁死亡可能在视网膜光损伤中起到重要作用。生物信息学分析显示铁死亡在视网膜光损伤中的作用方式是多基因、多靶点、多通路的,且很可能与AMD、RP等视网膜疾病的发生密切相关。