圆苞车前子壳粉对鸡肉肌原纤维蛋白凝胶特性和蛋白结构的影响

曹涓泉，李心悦，徐 静，屠 康, ，武 杰

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095；2.蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠 233000）

肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）是肉制品中重要的蛋白质，其在骨骼肌蛋白质中占比约为50%，在肌肉蛋白中含量最高[1]。热诱导MP 的凝胶特性是影响肉制品加工性能及其品质的关键因素，能够显著影响肉制品的质构、保水性等品质指标。传统肉制品中通常含有15%～30%富含饱和脂肪酸和胆固醇的动物脂肪，然而摄入过多动物脂肪对健康不利，这部分人会更容易患肥胖症、心血管疾病以及高血压[2]，直接降低脂肪又会导致肉制品品质下降。因此，在肉制品中加入各类脂肪代替物来改善肉制品品质成为了目前的研究热点。

目前，多糖已被广泛认为是一种优良的脂肪替代品。大量研究表明，多糖能够与蛋白质发生相互作用，通过添加多糖能够改善肉制品蛋白凝胶特性[3-5]，从而改善肉制品加工及品质特性。圆苞车前子壳粉（psyllium husk powder，PHP）是一种天然的膳食纤维来源，由车前子（一年生车前子属；Plantago asiatica）的种子壳制成，其主要成分为多糖[6]。众所周知，PHP 具有高含量的水溶性膳食纤维，它已被用作食品中膳食纤维补充剂[7]。有人通过研究摄入PHP 对胆固醇、血糖指数和饱腹感的影响，认为它可降低代谢综合征和心血管疾病的风险[8]。因此，日常减脂饮食中摄入圆苞车前子壳是有效预防肥胖相关疾病的措施之一[9]。此外，PHP 是一种高溶解性、高粘度的纤维，已被用作胶凝剂。其中含有的多糖成分如阿拉伯木聚糖，是与PHP 的高凝胶形成特性相关的主要成分[8]。因此，PHP 不仅能够作为天然的脂肪替代物，其在肉品加工特性和品质改善方面亦具有巨大潜力。研究证实，在鱼糜[10]和猪肉MP[11]中添加PHP，均能够有效改善蛋白凝胶特性和质构特性，促进蛋白凝胶微观结构更为致密均一。然而，目前关于PHP对肉制品蛋白凝胶特性和蛋白结构影响的研究仍然较少。PHP 在鸡肉制品品质改善中的应用以及对鸡肉MP 凝胶特性的影响未见报道。

因此，本文以鸡肉MP 为研究对象，通过研究不同PHP 添加量对其凝胶强度、保水性、动态流变学特性、水分分布特性的影响来分析其对鸡肉MP 凝胶特性的影响，并从MP 活性巯基含量、表面疏水性及二级结构含量等角度来探究蛋白结构的变化，以期为低脂鸡肉制品开发及其品质改善提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鸡胸肉 购于南京卫岗菜市场雨润肉制品专卖店；圆苞车前子壳粉（纯度99%；总膳食纤维为87.24%，蛋白质含量为0.78%，脂肪含量为0.4%，水分含量为2.67%） 宁陕国圣生物科技有限公司；氯化钾（KCl）、六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）、磷酸氢二钾，三水合物（K2HPO4·3H2O）、乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸（EGTA）、二硝基苯甲酸（DTNB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、1-苯胺基-8-磺酸（ANS）、牛血清白蛋白（albumin from bovine serum， BSA） 上海吉至生化科技有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

PD500-TP 高速匀浆机 英国Prima 公司；Avanti J-E 高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；Grindomix GM200 刀式混合研磨仪 德国Retsch 公司；SIM-F124 制冰机 日本三洋公司；Ultra Turrax T25 高速匀浆机 德国IKA 公司；TAXT2i 质构仪 英国Stable Micro Systems 公司；Spectral Max M2e 多功能酶标仪 德国MD 公司；HH-4 型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；Physica MCR 301 流变仪 奥地利Anton Paar 公司；NiumagPQ001 核磁共振成像分析仪 上海纽迈电子有限公司；J-1500 圆二色光谱仪 日本JASCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡肉肌原纤维蛋白的提取 根据Wang 等[12]的方法提取肌原纤维蛋白（MP），并稍作修改。采用医用无菌手术刀将新鲜鸡胸肉中可见的筋膜和脂肪去除，并切成小块，然后置于GM200 刀式混合研磨仪以3000 r/min 斩拌30 s（分成三次进行，防止产热），取鸡胸肉糜与磷酸缓冲溶液（含0.1 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4、 1 mmol/L EGTA、2 mmol/L MgCl2，pH7.0，4 ℃）以1:4（w/v）的比例混合。然后，使用高速匀浆机将混合物均质化（6700 r/min，1 min），然后通过双纱布过滤。随后将滤液在4 ℃下以2000×g 离心10 min，并去除上清液，将上述过程重复进行两次，以进一步去除杂质。然后，将收集的沉淀物与0.1 mmol/L KCl 溶液按1:4（w/v）的比例混合并均质（6700 r/min，1 min），然后用双纱布过滤均质液，接着在4 ℃下以2500×g离心10 min；上述过程重复一次，以获得最终的纯MP。整个提取过程在冰浴条件下进行，以避免蛋白质变性。

1.2.2 MP 浓度的测定 采用双缩脲法[11]测定纯MP 浓度。取1 mL 提取的鸡肉MP，加入4 mL 的双缩脲试剂，充分混合混匀，室温下静置30 min，在540 nm 处测定吸光值，根据牛血清蛋白标准曲线计算样品的蛋白质浓度。

1.2.3 MP-PHP 复合溶胶/凝胶的制备 参考Zhang等[13]的方法，将PHP 加入到MP 中，用PBS 缓冲液（0.6 mmol/L KCl，50 mmol/L K2HPO4/KH2PO4，pH7.0）将蛋白浓度稀释至40 mg/mL，分别加入PHP 0%、0.5%、1%、1.5%、2%（w/v），用高速匀浆机搅拌（6700 r/min，1 min）混合体系，使PHP 混合均匀，得到MP-PHP 复合溶胶。取出部分MP-PHP 复合溶胶置于80 ℃的水浴锅中加热30 min 形成复合凝胶；待加热结束后，将样品置于室温冷却，然后放入4 ℃冰箱中备用。

1.2.4 凝胶强度的测定 参考Zhuang 等[14]的方法，取MP-PHP 复合溶胶8 g 放于10 mL 烧杯中，用保鲜膜密封，置于80 ℃的水浴锅中加热30 min 形成凝胶，待加热结束后，将样品冷却至室温，4 ℃静置过夜，切成20 mm 高的圆柱。用TA-XT2i 质构仪进行凝胶强度的测定，参数如下：探头型号：P/0.5 S；测前速度：1.5 mm/s；触发力：5 g；压缩距离：5 mm。

1.2.5 凝胶保水性的测定 参照Kocher 等[15]的方法进行测定。取制备好的凝胶样品8 g 置于10 mL塑料离心管，记录离心管重量（W1）以及加入凝胶样品之后的总重量（W2），以10000 r/min 于4 ℃离心10 min，用吸水纸将离心出的水分去除后称取离心管重量（W3），每组样品重复测定5 次。

其中，W1表示离心管重量（g），W2表示离心管和离心前样品的总重量（g），W3表示离心管和离心后去除水分的样品的总重量（g）。

1.2.6 流变特性的测定 参照Gao 等[16]的方法测定含有不同浓度MP-PHP 复合溶胶的流变学特性。采用直径为50 mm 的不锈钢平行板探头，平板与平板之间的间隙为1.0 mm。取10 g 溶胶均匀涂抹于两块平板之间，平板周边用薄层液体硅油处理，防止样品边缘脱水和水分从样品中蒸发。在20 ℃初始温度下平衡5 min 后，样品从20 ℃持续加热到最终温度80 ℃。在加热过程中，样品以固定频率0.1 Hz和2%的应变进行动态温度扫描测试。在设定参数后，测量了样品随温度升高过程中储能模量（G′）及损耗模量（G′）的变化。每个处理重复3 次。

1.2.7 水分分布特性的测定 参照于晶超等[17]的方法并略作修改。利用NiumagPQ001 核磁共振成像分析仪对复合凝胶的水分分布特性及水分组成进行分析。将约8 g 的凝胶样品（制备方法同1.2.3）用保鲜膜包裹住，放入核磁管中进行试验。用CPMG 序列测量横向弛豫时间T2，参数设置为：主频率SF 为40 MHz，90°脉冲射频脉宽P1=8 μs，180°脉冲射频脉宽P2=14 μs，信号采样点数TD=750036，采样频率SW=125 kHz，采样间隔时间TW=3500 ms，回波个数NECH=12000，累加次数NS=32。

1.2.8 表面疏水性的测定 参考Creamer 等[18]的疏水探针结合法测量MP 的表面疏水性，并以ANS 作为荧光探针。将样品的蛋白浓度用PBS 缓冲液稀释至1 mg/mL，将20 μL ANS 溶液（15 mmol/L ANS，0.6 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH7.0）加入到4 mL 样品中。将样品混合均匀，然后在室温下在黑暗中孵育20 min。待反应结束，使用酶标仪在激发波长为370 nm，发射波长为420～570 nm 处测量其荧光强度。

1.2.9 活性巯基的测定 参考刘旺[19]的方法，将样品的蛋白浓度用PBS 缓冲液稀释至1 mg/mL，分别加入20 μL DTNB 混合均匀，并在室温下反应1 h。测量样品412 nm 处的吸光度。活性巯基含量按如下公式计算。

其中：C0为活性巯基含量（mmol/g）；A 是样品在412 nm 处的吸光度；ε为摩尔消光系数（13600/（mol·cm/L））；D 为稀释倍数；ρ为蛋白质质量浓度（mg/mL）。

1.2.10 二级结构的测定 参考Li 等[20]的方法，使用J-1500 圆二色光谱仪来测定蛋白质的二级结构。将样品蛋白浓度用PBS 缓冲液稀释至0.2 mg/mL。将样品（约200 μL）注入1 mm 光程的石英比色皿中，比色皿放入仪器中进行信号采集，测定不同组间的样品前要润洗两次。在200～260 nm 的波长范围内进行扫描，扫描速率为100 nm/min，用PBS 溶液进行基线采集，蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规则卷曲的含量根据PCDDB 数据库（Protein Circular Dichrosim Data Bank）提供的算法进行计算。

1.3 数据处理

以上所有实验均重复3 次，结果均以平均值±标准差表示。采用Origin 2022b 和SPSS 18.0 对数据进行分析处理，利用Duncan’s 多重比较进行组间差异显著性分析，P＜0.05 时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PHP 添加量对MP 表观形态的影响

对于消费者而言，肉糜制品表观形态最关重要。如图1 所示，经过蒸煮并冷却后，不同PHP 添加量的MP 凝胶表观形态具有明显的差异。当不添加PHP 时，MP 凝胶较为松软，成型效果较差，0.5%的添加量对于其成型效果有所改善，但形成的凝胶仍然较松软。随着PHP 添加量的增加（0.5%～1.5%），MPPHP 凝胶体系成型效果逐渐改善。然而，当继续增加PHP 添加量至2.0%时，MP-PHP 凝胶体系中出现少量气泡。因此，添加1.5% PHP 对于鸡肉MP 凝胶形成表观形态具有较好改善作用。

图1 不同PHP 添加量对鸡肉MP 凝胶形成表观形态的影响Fig.1 Effect of various amounts of psyllium husk powder on apparent morphology of chicken MP gel

2.2 PHP 对鸡肉MP 凝胶强度的影响

凝胶强度反映了MP 热诱导凝胶化过程中蛋白质的聚集交联程度[14]。从图2 中可以看出所有试验组的凝胶强度均高于对照组，说明PHP 的加入显著提高了MP 的凝胶强度（P＜0.05）；随着PHP 添加量的增加，MP 的凝胶强度呈先升高后降低的趋势；当PHP 添加量为1.5%，复合凝胶的凝胶强度最高达73.79 g·mm。Zhou 等[11]和朱士臣等[10]将PHP 分别应用于猪肉MP 凝胶和鱼糜凝胶中也得到了类似结果，这可能是由于PHP 可以促进鸡肉MP 结构的展开，更多的疏水基团暴露，从而使车前子多糖在高温条件下能够与MP 相互作用[17]，形成了更稳定的蛋白凝胶三维网络结构，使得凝胶强度增加；而当PHP 的添加量达到2%，与1.5%添加量相比凝胶强度稍有下降，但变化并没有显著差异（P＞0.05），猜测可能是由于过量的车前子多糖阻碍了MP 的疏水基团之间的交联作用，导致凝胶强度稍有降低。

图2 不同PHP 添加量对鸡肉MP 凝胶强度的影响Fig.2 Effect of various amounts of psyllium husk powder on gel strength of chicken myofibrillar protein

2.3 PHP 对鸡肉MP 凝胶保水性的影响

蛋白凝胶的保水性通常与肉制品的蒸煮损失和产品得率有关[21]，因此测定了保水性以表征MP 凝胶三维网络结构对水分的束缚能力。如图3 所示，PHP 的加入显著提高了MP 的保水性（P＜0.05），且随着其添加量的增加保水性呈上升趋势。当PHP 添加量从0%提高到1.5%时，保水性由51.81%显著提高到80.51%（P＜0.05），高出对照组28.7%；而当继续增加PHP 添加量至2%时，保水性仅略微增加，但与1.5%添加量相比无显著变化（P＞0.05）。结果说明，适量PHP 的添加可以有效改善MP 凝胶的保水性，这与PHP 本身具有很好的吸水性和保水能力有关[22]；此外，PHP 对保水性的提高是受浓度限制的，即当PHP 的添加量由1.5%增加到2%时并未实现保水性的继续显著增加，这与韩芳蕊等[23]的研究结果一致。因此，添加1.5%的PHP 是有效改善MP 保水性的有效途径。

图3 不同PHP 添加量对鸡肉MP 凝胶保水性的影响Fig.3 Effect of various amounts of psyllium husk powder on water holding capacity of chicken myofibrillar protein gel

2.4 PHP 对鸡肉MP 流变特性的影响

MP 凝胶网络形成过程中的粘弹性变化可以通过动态流变学测量来确定，通过储能模量（G′）和损耗模量（G′′）的变化分别反映加热过程中蛋白质的弹性和粘度变化[24]。如图4 所示，MP-PHP 复合体系中G′的在加热过程中表现出三个阶段，G′在45 至50 ℃之间明显增加，此时肌球蛋白头部变性及交联，凝胶网络开始初步形成[25]；G′在50 至60 ℃之间降低，这时肌球蛋白的尾部逐步展开，热变性的增加导致蛋白质分子的重组和重新排列；G′在60～70 ℃的温度范围内急剧增加，这是因为温度的进一步升高使蛋白充分变性，形成了稳定的凝胶网络结构[3]。当添加的PHP 从0.5%增加到1.5%，凝胶体系的G′增加，表明PHP 的亲水性可以有效增强MP 凝胶的弹性，促进MP 形成更好的凝胶结构。然而，当PHP 的添加量提高至2%时，G′反而降低。动态流变特性结果与凝胶强度一致，证实了适量PHP 的加入对MP 凝胶性能的有益影响。G″值被广泛用于描述凝胶的粘度。一般来说，粘度越大，凝胶的保水性越好；G″越大，就越容易形成更密集、更均匀的凝胶结构，有效地捕获和固定水[20]。在本研究中，加入PHP 的复合凝胶的G″值相对于纯MP 凝胶的G″值更高，且随着PHP 浓度的增高而增大，且加入1.5%和2% PHP的复合凝胶的G″值差异较小，这与保水性的结构一致。由此可见，添加了PHP 的混合凝胶有较好的凝胶形成能力，考虑性价比，添加量为1.5%时复合凝胶的粘弹性较适宜。

图4 不同PHP 添加量对鸡肉MP 凝胶储能模量（G′）和损耗模量（G″）的影响Fig.4 Effect of various amounts of psyllium husk powder on storage modulus (G′) and loss modulus (G″) of chicken myofibrillar protein gel

2.5 PHP 对鸡肉MP 凝胶水分分布特性的影响

横向弛豫时间T2可以反映出底物与水分的结合是否紧密，也就是水分自由程度[26]。通过T2分布表征MP-PHP 复合凝胶中多种水分的分布状态，由图5 可见，出峰时间主要集中在1～100 ms（T21），100～1000 ms（T22）和1000～10000 ms（T23），分别对应结合水、不易流动水和自由水[23]。结合水是指能够与蛋白分子紧密结合的水，不易流动水是指存在于肌纤维网络中的水，自由水是指不受凝胶体系束缚因而可以自由流动的水[27]。从表1 可以看出，随着PHP含量不断增加（0%～1.5%），混合凝胶中结合水和不易流动水比例分别在0.39%～1.27%和86.46%～94.14%范围内呈显著上升趋势（P＜0.05），相反地，自由水比例在13.16%～4.59%范围内不断下降；然而，当PHP添加量继续增加到2%时，MP-PHP 复合凝胶中水分自由程度未发生明显变化。值得注意的是，相比1.5%的PHP 添加量，2%的添加量下未观察到复合凝胶中不易流动水比例的进一步增加。可能的原因是：一方面，适量PHP 的添加（添加量范围为0.5%～1.5%时，P＜0.05；添加量范围为1.5%～2.0%时，P＞0.05）使得复合凝胶保水性不断增加；另一方面，PHP 的过量添加可能导致复合凝胶对水分的过多吸收，从而破坏凝胶结构的致密性，使蛋白质和多糖发生相分离[10]，最终导致复合凝胶保水性的降低。因此，添加1.5%的PHP 能够有效促进自由水的减少和不易流动水的增加，即提高复合凝胶的保水性，这与前文保水性描述结果一致。

表1 不同PHP 添加量的鸡肉MP 凝胶低场核磁驰豫面积分数（%）Table 1 NMR transverse peak area fraction of water from chicken myofibrillar protein gel with various amounts of psyllium husk powder (%)

图5 不同PHP 添加量对鸡肉MP 凝胶水分NMR T2 弛豫时间分布规律的影响Fig.5 Effect of various amounts of psyllium husk powder on the distribution of the T2 of chicken myofibrillar protein gel

2.6 PHP 对鸡肉MP 表面疏水性的影响

表面疏水性一般用来判断蛋白质内部疏水基团的暴露情况，它的改变可以引起蛋白质三级结构的改变，在蛋白质功能特性中起着重要作用[28]。由图6可知，与对照组相比，添加PHP 后，MP 表面疏水基团均明显减少，并且随着PHP 添加量的增加呈现先减少后增加的趋势，其中添加1.5% PHP 的样品表面疏水性最低。随着PHP 的加入（0.5%～1.5%），表面疏水性的降低可能归因于PHP 中的亲水性多糖与MP 分子结合，导致蛋白质表面的疏水基团被覆盖[29]，从而抑制ANS 与这些基团的结合而展现出较低的MP 表面疏水性。这一结果与于晶超等[17]的研究结果相一致，其发现可得然胶-猪肉MP 混合体系的表面疏水性低于猪肉MP。然而，当继续增加PHP 添加量至2%时，MP-PHP 混合体系表面疏水性有所增加，这可能与过量的PHP 与水竞争蛋白质分子的结合位点从而削弱了蛋白质的水合作用有关[30]。因此，添加1.5%的PHP 能够有效降低MP-PHP 体系的疏水性，改善MP-PHP 体系分散程度，这可能是促进蛋白凝胶网络形成的重要原因。

图6 不同PHP 添加量对鸡肉MP 表面疏水性的影响Fig.6 Effect of various amounts of psyllium husk powder on surface hydrophobicity of chicken myofibrillar protein

2.7 PHP 对鸡肉MP 活性巯基含量的影响

活性巯基是指暴露在蛋白质分子表面的巯基，它是表达蛋白质功能的重要活性基团[31]。由图7 可知，当PHP 添加到1%，活性巯基含量显著增加（P＜0.05），1.5%的添加量次之但与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。说明适量PHP 的加入可以促进蛋白质分子结构展开，使巯基暴露在蛋白质分子表面[32]，随着添加量上升到2%，可能由于圆苞车前子多糖与蛋白质相分离[33]，使蛋白质分子重新聚集并相互交联，原先暴露在蛋白质分子表面的活性巯基又重新包埋于蛋白质分子内部，使活性巯基含量显著低于对照组（P＜0.05）。

图7 不同PHP 添加量对鸡肉MP 活性巯基含量的影响Fig.7 Effect of various amounts of psyllium husk powder on reactive sulfhydryl group content of chicken myofibrillar protein

2.8 PHP 对鸡肉MP 二级结构的影响

使用J-1500 圆二色光谱仪测定了MP 的二级结构含量，以探究其内部二级结构的变化。如表2 所示，α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠和β-转角含量随着PHP 添加量的增加呈现不同程度的变化规律。当PHP 添加量为1%时，无规则卷曲和β-折叠含量分别达到最小值（22.62%）和最大值（33.54%），相比对照组分别降低了35.67%和增加了66.78%（P＜0.05）；而当PHP 添加量为1.5%时，α-螺旋和β-转角含量分别达到最小值（17.31%）和最大值（26.16%），相比对照组分别降低了31.80%和增加了35.05%（P＜0.05）。总的来说，0.5%～2.0% PHP 的加入均导致了α-螺旋和无规则卷曲含量的减少以及β-折叠和β-转角含量的增加。这与Chen 等[34]的研究结果相似，其研究表明，瓜尔豆胶能够显著降低大豆分离蛋白凝胶中的α-螺旋含量而增加β-折叠含量。有研究表明，蛋白质分子的变性和展开导致α-螺旋向β-折叠的转变，而MP 凝胶中β-折叠和β-转角含量增加使MP 凝胶具有更好的凝胶特性，可以提高复合凝胶的凝胶强度[16,20]。此外，Xiao 等[35]研究发现，麦麸纤维素的加入导致了大豆分离蛋白凝胶中α-螺旋含量的显著降低及β-折叠含量的显著增加，从而促进了更均匀和致密的凝胶网络结构的形成。综合本研究结果，1.5%可作为促进α-螺旋和无规则卷曲向β-折叠和β-转角的转变。当PHP 添加量增加至2%时，可能由于蛋白质和多糖两相混合体系发生相分离，使蛋白质聚合而重新形成α-螺旋结构，从而使α-螺旋含量呈现一定上升趋势[33]。因此，1.5% PHP 的加入可以有效促进蛋白质分子的展开和交联，有利于改善凝胶的功能特性。

表2 不同PHP 添加量对鸡肉MP 二级结构的影响Table 2 Effect of various amounts of psyllium husk powder on the secondary structure of chicken myofibrillar protein

3 结论

本文采用肌肉MP 为研究对象，研究不同PHP添加量对其凝胶特性（凝胶强度、保水性、流变性、水分分布特性）和蛋白结构性质（表面疏水性、活性巯基含量、二级结构）的影响。研究结果表明，添加1.5%的PHP 能够显著提高鸡肉MP 的凝胶强度、保水性和粘弹性（P＜0.05）；同时，自由水向不易流动水的转化进一步证实了添加PHP 对MP 保水性的改善。另一方面，1.5% PHP 的添加能够显著降低鸡肉MP 表面疏水性，并能促使MP 中α-螺旋和无规则卷曲向β-折叠与β-转角转变，这对于改善蛋白凝胶特性具有重要作用。此外，添加1% PHP 能够显著提高MP 中活性巯基含量（P＜0.05）；1.5% PHP 的添加效果次之，但与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。总之，1.5% PHP 的添加能够有效改善MP 的凝胶特性及蛋白结构，说明脂肪替代物PHP 的添加在改善鸡肉制品品质方面具有巨大应用潜力。微观结构表征将更好的助力于揭示添加PHP 对鸡肉MP 凝胶特性改善机制。