西番莲果皮多糖锌的结构表征和益生元作用

杨 可，李 霞，李海鹏，姜铁民，李 静，关 媛，陈海珊，李丽芬,

（1.桂林理工大学化学与生物学院，广西桂林 541006；2.广西植物研究所，广西桂林 541006）

西番莲（Passiflora edulisSims），又称百香果，鸡蛋果，是一种热带攀缘藤本植物，主要分布于两广、福建、海南、台湾等地，由于其独特的风味和营养特征备受人们喜爱[1-3]。西番莲果皮作为西番莲工业生产的主要副产品，其比重占总果的45%～55%，包含丰富的膳食纤维以及活性物质，如多糖、黄酮、多酚和生物碱等[4-6]。多糖作为西番莲果皮主要活性物质之一，具有良好的抗氧化、抗肠炎以及增强肠道保护等多种生物活性[7-10]。西番莲果皮多糖还具有益生元作用，在羧甲基化修饰后，其益生元作用有所提升[11]。

锌作为人体必不可少的微量元素之一，在维持蛋白质和DNA 合成、调节细胞生长、增殖和代谢等方面发挥着重要作用[12-13]。锌不能在体内合成，只能通过膳食补充剂摄入，缺锌会导致各种高危疾病的患病率增加，如侏儒症[14-15]、冠心病、糖尿病、厌食症、心脑血管疾病、慢性肾脏疾病和癌症等[16-17]疾病，锌摄入量不足、排泄过多[18]和使用障碍是导致人体患有上述疾病的常见原因。多糖锌配合物是由多糖与锌离子配合而成，与无机锌相比，其副作用小、利用率高、对胃肠道刺激小、生物活性高[19-21]。有研究发现，黄芪多糖锌对糖尿病大鼠具有较强的降血糖作用[22]，杏鲍菇菌丝多糖锌具有预防高脂血症的作用[23]，南瓜果皮多糖锌对斑马鱼炎症细胞具有较好的抑制作用[24]，但是关于天然多糖锌复合物的益生元作用的研究鲜有报道。

本研究将西番莲果皮多糖与七水硫酸锌配合得到西番莲果皮多糖锌，对西番莲果皮多糖锌的理化性质与结构进行了检测分析，并探究了其益生元作用。本研究为西番莲资源的有效利用提供了新的方向，为多糖锌在功能食品领域的开发以及在益生领域的探索提供了一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西番莲（Passiflora edulisSims） 广西桂林市，十月份采摘；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii（subsp.）bulgaricus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus） 广东省微生物菌种保藏中心；低聚果糖（Fructooligosaccharides，FOS）、大豆蛋白胨 上海源叶生物科技有限公司；大豆卵磷脂 上海贤鼎生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海凛恩科技发展有限公司；刚果红 上海麦克林生化科技股份有限公司；磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、氢氧化钠、盐酸 西陇科学股份有限公司；酵母浸粉 北京陆桥技术有限责任公司；牛肉浸粉 青岛高科园海博生物科技有限公司；乙酸钠等其他试剂 均为分析级及以上。

YKSL-1200X 马弗炉 合肥科晶材料技术有限公司；ALPHA1-2 LD 冷冻干燥机 德国Martin Christ公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；YK722PC 可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；LRH-250-Z 振荡培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司；3000Da 透析袋 北京瑞达恒辉科技发展有限公司；SDT Q600 热重-差热分析仪 美国TA Instrument 公司；XPert3Power X-射线衍射仪 荷兰帕纳科公司；IS10 傅立叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher 公司；YK722PC 紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；iMark酶标仪 Bio-Rad Laboratories；S-5000 电镜扫描仪日立有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖锌配合物的制备 根据Guan 等[25]的方法，用水提法制备得到西番莲果皮粗多糖（Water extracted polysaccharide fromPassiflora edulisSims peel，WPEP）。将1.0 g WPEP 溶于250 mL 蒸馏水中，加入0.88 g ZnSO4·7 H2O（溶于20 mL 0.1 mol/L HCl 中），调节pH 至6.0，于60 ℃条件下反应2 h，流水透析48 h，浓缩并冷冻干燥得到西番莲果皮多糖锌配合物（WPEP-Zn）。

1.2.2 理化性质检测

1.2.2.1 锌含量的测定 取100 mg WPEP-Zn 在马弗炉中高温灰化3.5 h，温度设置为550 ℃。灰化后的WPEP-Zn 溶于少量稀硝酸，加水至10 mL 备用。取一定量ZnSO4·7H2O 配制浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/L 的锌标准溶液备用[26]。采用可见分光光度计测定WPEP、WPEP-Zn 和系列标准溶液的吸光度并计算锌含量，测得标准曲线方程为Y=0.2611X-0.0148，R2=0.9956。

1.2.2.2 溶解性的测定 取50 mg WPEP 与WPEPZn 分别加入5 mL 蒸馏水，室温下混合90 min 后在8000 r/min 下离心30 min。移去上清液，烘干后称量剩余多糖质量。溶解性计算公式如下：

式中：W0表示溶解前多糖质量，mg；W1表示溶解后剩余多糖质量，mg。

1.2.2.3 总糖含量和糖醛酸含量的测定 采用苯酚硫酸法[27]和间羟基联苯法[28]检测WPEP 与WPEPZn 的总糖含量与糖醛酸含量，测得总糖含量标准曲线方程为Y=13.847X+0.0556，R2=0.9989，糖醛酸含量标准曲线方程为Y=11.128X+0.0274，R2=0.9905。

1.2.3 结构表征

1.2.3.1 刚果红实验 1 mL WPEP 和WPEP-Zn 溶液（1 mg/mL）与1 mL 刚果红溶液（80 μmol/L）混合，加入NaOH（1 mol/L）溶液混合至NaOH 最终浓度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L，室温静置10 min，紫外分光光度计在400～600 nm 扫描检测最大吸收波长[29]。

1.2.3.2 傅里叶变换红外光谱检测 称取一定量的WPEP 和WPEP-Zn，分别加入100 mg 溴化钾研磨压片，在4000～500 cm-1波数范围内进行红外光谱扫描[30]。

1.2.3.3 X 射线衍射（XRD）检测 采用X-射线衍射仪进行扫描测定，衍射条件为：Cu-Kα衍射，管压40 kV，管流40 mA，角度5.00°～90.00°，角度梯度0.02°、扫描速度10°/min。

1.2.3.4 扫描电子显微镜（SEM）检测 用导电胶将多糖粘在样品台上，在真空喷镀仪内喷上金膜，扫描电子显微镜下观察样品表面形态。条件为电压：5 kv，电流：9.9 A。

1.2.3.5 热重检测 分别称取10 mg WPEP 和WPEPZn 于坩埚中，以空白陶瓷坩埚作空白参照，氮气为保护气，在热重分析仪上进行热分解，实验条件设置温度为10～800 ℃，升温速率为10 ℃/min[31]。

1.2.4 多糖的益生元作用

1.2.4.1 培养基的配制 MRS 基础培养基：大豆蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉10.0 g，酵母浸粉5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸锰0.05 g，硫酸镁0.30 g，吐温-80 ℃ 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，溶至1000 mL 水中，pH6.5。液体培养基：在MRS 基础培养基的基础上加1%的葡萄糖所得。固体培养基：为在液体培养基的基础上加1.5%的琼脂所得。

1.2.4.2 菌种活化 液体培养：配置液体培养基，高压灭菌，设置时间为20 min，温度为121 ℃。灭菌结束后分别4 种益生菌接种到液体培养基中，37 ℃下培养48 h。固体培养：将液体培养基中培养的4 种益生菌分别接种至固体培养基中，在37 ℃下培养48 h，再将益生菌接种于液体培养基中培养12 h 进行二次活化，培养条件与液体培养条件相同。

1.2.4.3 不同浓度多糖对益生菌增殖的影响 在MRS 基础培养基中加入质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0%（W/V）的FOS、WPEP 和WPEP-Zn，分别接入上述4 种二次活化后益生菌，在37 ℃环境下振荡培养36 h，测定不同多糖浓度下培养液的OD570nm，确定促进益生菌增殖的最佳多糖浓度。

1.2.4.4 多糖对益生菌生长曲线的影响 根据张国柱[32]的方法做出部分修改，实验以低聚果糖作阳性对照，以MRS 基础培养基作空白组阴性对照。在200 μL 空白组和最佳质量多糖浓度下的FOS 组、WPEP 组和WPEP-Zn 组培养基中分别加入100 μL二次活化后的4 种益生菌，培养36 h，每间隔2 h 测定培养液的OD570nm。以培养时间为横坐标，以OD570nm为纵坐标代表益生菌的生长状况，绘制益生菌的生长曲线，探究WPEP 及WPEP-Zn 对4 种益生菌生长的影响。

1.3 数据处理

所有实验重复3 次，实验数据以平均值±标准误差的形式表示，采用SPSS22.0 处理和分析数据，采用Origin pro 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 理化性质分析

理化性质分析结果如表1 所示。WPEP-Zn 的总糖和糖醛酸含量分别从配合前的28.52%和72.03%降至23.26%和50.46%，多糖与锌配合后总糖含量与糖醛酸含量存在显著性差异（P＜0.05）。溶解性从97.8%升至98.07%，无显著性差异（P＞0.05）。WPEP未检测到Zn，WPEP-Zn 的锌含量为10.64±0.5 mg/g。锌的配合改变了WPEP 的理化性质，配合后的多糖总糖含量和糖醛酸含量明显降低，锌含量增加。

表1 WPEP 与WPEP-Zn 的理化性质Table 1 Physicochemical properties of WPEP and WPEP-Zn

2.2 刚果红测试分析

WPEP、WPEP-Zn 的刚果红测试结果如图1 所示。多糖的三螺旋结构使得其结构复杂多样，能够承载更多的生物信息，同时有利于多糖生物活性的提高[33]。刚果红溶液是一种弱碱性的溶液，具有三螺旋结构的多糖与碱性的刚果红溶液能够形成复合物。WPEP 与WPEP-Zn 在NaOH 浓度为0.05～0.15 mg/mL的最大吸收波长与碱性刚果红溶液相比发生了红移，且在NaOH 浓度为0.1 mol/L 时波长最大，随着碱浓度的升高，WPEP 与WPEP-Zn 中的三螺旋结构被破坏，两种多糖的最大吸收波长逐渐降低，三股螺旋结构逐渐解旋，这与常相娜等[34]所做的香菇多糖的刚果红实验一致。结果说明WPEP-Zn 具有多糖的三螺旋结构。

图1 刚果红实验波峰图Fig.1 Peak diagram of Congo red test

2.3 傅里叶红外光谱分析

由图2 可知，配合前后的多糖红外光谱在3440 cm-1左右均有强吸收峰，是多糖分子间或分子内的O-H的伸缩振动引起的；在2700～3000 cm-1之间出现了弱吸收峰，是糖类不对称C-H 的伸缩振动引起的；1600 cm-1左右强吸收峰属于C=O 的伸缩振动；在1362 cm-1左右的吸收峰为O-H 的弯曲振动吸收峰；1000～1200 cm-1范围内的吸收峰属于C-O-C 和CO-H 的伸缩振动；1015.13、1068.92、1148.15 cm-1左右的C-O 吸收峰表明存在吡喃环结构[35]。WPEP与锌配合后，属于O-H 的伸缩振动产生的特征吸收峰由3443.08 cm-1处移动到3443.98 cm-1，推测WPEP 与锌结合是通过Zn-O 键进行连接[36]；在500～1000 cm-1范围内，相比于WPEP，WPEP-Zn 在562.48 cm-1处未出现峰值，但在531.99 cm-1和920.48 cm-1处产生了新的特征峰。所有吸收峰的变化都与多糖和锌的相互作用力变化有关，说明配合后多糖结构发生了变化[36]。

图2 WPEP 与WPEP-Zn 的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of WPEP and WPEP-Zn

2.4 XRD 分析

WPEP、WPEP-Zn 的XRD 扫描结果如图3 所示。WPEP 与WPEP-Zn 的衍射图在2θ=21°处均有结晶度峰。在29.7°和30.6°时，WPEP 出现了两个吸收波峰，且在角度为35°～42°时，WPEP 也有较小波峰出现，而WPEP-Zn 在此角度的波峰降低。在43°时，WPEP 与WPEP-Zn 均出现了一个小的特征峰，WPEP 峰值相对较高。结果表明，西番莲果皮多糖经过与锌的配合后，结晶区域和类型发生变化，相较WPEP，WPEPZn 的峰形变宽，峰形变圆钝，配合后多糖的结晶度有所下降[37]。曾凡珂等[38]报道的荸荠皮多糖的XRD图谱衍射峰主要集中在2θ为20°～30°范围内，峰形与WPEP 和WPEP-Zn 接近，结晶程度低，溶解性和生物利用度较好。结晶度可能与溶解度呈负相关，溶解性越好，其相对结晶度越低[39]，相较WPEP，WPEPZn 结晶度有所下降，但由表1 可以看出WPEP 和WPEP-Zn 溶解性无显著性差异，说明配合后的多糖仍主要以非定型的结晶态存在[37]。

图3 WPEP 与WPEP-Zn 的XRD 衍射图Fig.3 XRD patterns of WPEP and WPEP-Zn

2.5 SEM 分析

WPEP、WPEP-Zn 的SEM 扫描结果如图4 所示。从图4A、C 看出，WPEP 表面较为平整、光滑，结构紧密，表面积大，说明多糖的链聚集紧密。WPEP-Zn呈现蜂巢状，表面有龟裂，粗糙不规整，说明多糖与锌不仅存在配合，也有可能存在锌的物理吸附[40]。从图4B、D 可以看出WPEP 表面结构表现出不规则的片状，WPEP-Zn 同样为不规则的片状结构但更均匀，可能是WPEP 与锌离子配合后分子间作用力增加，结构分布发生改变，这与Zhou 等[31]的结果一致。表明锌与WPEP 的配合不仅是在空间结构上改变了WPEP，还存在锌的物理吸附现象，使得多糖表面结构发生明显改变。

图4 WPEP 与WPEP-Zn 的电镜扫描Fig.4 Scanning electron microscope of WPEP and WPEP-Zn

2.6 热重分析

WPEP，WPEP-Zn 的热重实验结果如图5 所示。多糖结构和官能团差异会影响热行为并影响温度转变。WPEP 在30～187 ℃时，失重率为19.08%，在此阶段主要是失去多糖中的游离水；在187～250 ℃时，失重率为47.46%；在250～371 ℃时，失重率为12.73%；在371～389 ℃时，失重率为11.18%。WPEP-Zn 在30～222 ℃时，主要失去的是多糖的自由水，失重率为21.25%；在222～347 ℃时，失重率为50.49%，本阶段多糖大量的受热分解；在347～425 ℃时，多糖失重率为5.50%；在425～445 ℃时，失重率为8.33%，此后阶段保持平稳。在热重分析中可以看出，WPEP 比WPEP-Zn 先出现大幅度失重，WPEP 在187 ℃时开始大量分解，而WPEP-Zn 在222 ℃时开始大量分解，随着温度继续升高，WPEP 与WPEP-Zn 再次出现较小幅度失重现象，最后，两者分别在371 ℃和425 ℃时，彻底的被热分解。说明了锌的配合使得多糖热稳定性有了显著的提升，这与Bai 等[41]在大蒜多糖锌的热重分析中所得的结果一致。

图5 WPEP 与WPEP-Zn 的热重分析Fig.5 Thermogravimetric analysis of WPEP and WPEP-Zn

2.7 多糖的益生元作用分析

2.7.1 不同浓度的多糖对益生菌的增殖作用分析不同浓度多糖对4 种益生菌的益生元作用结果如图6～图9 所示。以OD570nm大小代表实验菌体的生长状况，在第36 h 比较不同质量浓度多糖对益生菌的促进增殖效果。如图6～图9 所示，可知WPEP和WPEP-Zn 对4 种益生菌促进增殖的最佳质量浓度分别为2%、2%、2%、3%和3%、2%、2%、2%。

图6 不同浓度多糖对植物乳杆菌吸光度值的影响Fig.6 Effect of different concentrations of polysaccharides on OD value of Lactobacillus plantarum

图7 不同浓度多糖对德式乳杆菌保加利亚亚种吸光度值的影响Fig.7 Effect of different concentrations of polysaccharide on OD value of Lactobacillus delbrueckii （subsp.） bulgaricus

图8 不同浓度多糖对短乳杆菌吸光度值的影响Fig.8 Effect of different concentrations of polysaccharide on OD value of Lactobacillus brevis

图9 不同浓度多糖对嗜热链球菌吸光度值的影响Fig.9 Effect of different concentrations of polysaccharides on OD value of Streptococcus thermophilus

2.7.2 最佳质量浓度下的多糖对益生菌生长曲线的作用分析 分别以促进益生菌增殖的最佳质量浓度下的WPEP、WPEP-Zn 和FOS 作为碳源，以空白组为对照，绘制4 种益生菌的生长曲线，并在生长结束时间点进行显著差异性分析，结果如图10～图13 所示。图10 中可以看出，在植物乳杆菌生长稳定后，WPEP-Zn 组的OD570nm明显高于空白组但低于WPEP组和FOS 组，四组间存在显著差异（P＜0.05）。由图11和图12 可知，在德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌生长稳定后，WPEP-Zn 组的OD570nm稍高于空白组但两组之间不存在显著差异（P＞0.05），而WPEPZn 组的OD570nm均低于WPEP组和FOS 组且三组间相互存在显著差异（P＜0.05）。从图13 中可以看出，在嗜热链球菌生长稳定后，WPEP-Zn 组的OD570nm明显高于WPEP 组和空白组且存在显著差异（P＜0.05），低于FOS 组且存在显著性差异（P＜0.05）。

图10 最佳浓度多糖对植物乳杆菌生长曲线的影响Fig.10 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Lactobacillus plantarum

图11 最佳浓度多糖对德氏乳杆菌保加利亚亚种生长曲线的影响Fig.11 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Lactobacillus delbrueckii （subsp.） bulgaricus

图12 最佳浓度多糖对短乳杆菌生长曲线的影响Fig.12 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Lactobacillus brevis

图13 最佳浓度多糖对嗜热链球菌生长曲线的影响Fig.13 Effect of optimum concentration of polysaccharide on growth curve of Streptococcus thermophilus

在植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌的生长曲线中可以看出，WPEP 组OD570nm明显高于空白组与WPEP-Zn 组，证明WPEP 组对这3 种益生菌具有明显的促进增殖作用；WPEP-Zn组仅在植物乳杆菌的生长曲线中OD570nm明显高于对照组，表现出明显的促进增殖作用，对另外2 种益生菌无明显促进增殖作用，这可能与锌在细胞外的浓度过高有关，使细胞的膜运输降低[42]。在嗜热链球菌的生长曲线中可以看出，WPEP 组OD570nm稍高于对照组但无显著性差异，未表现出明显的促进增殖作用；WPEP-Zn 组OD570nm明显高于WPEP 组和空白组，说明WPEP 经过与锌配合后，多糖结构的改变或锌含量的增加对嗜热链球菌的增殖具有更好的促进作用，具体作用机理有待进一步研究。

3 结论

本研究使用WPEP 与七水硫酸锌配合得到WPEP-Zn，对其进行结构表征并探究其益生元作用。WPEP-Zn 相较配合前的总糖含量和糖醛酸含量分别从28.52%和72.03%降至23.26%和50.46%。配合后多糖仍具有三螺旋结构，结晶区域与类型以及表面特征发生了明显的变化，热稳定性明显增加。WPEP 与锌配合后结构的变化以及锌含量的提升对植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌的益生元作用下降，但对嗜热链球菌的益生元作用有所提高，说明配合后多糖具备一定的益生元作用，对后续多糖补锌剂的研究具有一定的推动作用。本研究证明了多糖与金属锌的配合具有可观的发展潜力，为西番莲资源利用提供了新的方向以及为新型多糖补锌剂的发展提供了一定的理论依据。