生活污水中苯二氮䓬类药物及其新型策划药分析方法优化及应用

朱 珠，张苓荣，赵孟林，张 璇，郝芳华，李喜青，杜 鹏

1. 北京师范大学水科学研究院，城市水循环与海绵城市技术北京市重点实验室，北京 100875

2. 北京大学城市与环境学院，地表过程分析与模拟教育部重点实验室，北京 100871

苯二氮䓬类药物(benzodiazepines，BZDs)作为精神科门诊普遍使用的强效镇静安眠药物，连续使用易形成药物依赖，在全球范围内已出现普遍的滥用现象[1-2]. 新型苯二氮䓬类策划药(designer benzodiazepines，DBZDs)则多为常用BZDs 的结构修饰物，药效与BZDs相似，但在国内未通过药物监管部门的上市批准. 因缺少法律监管，DBZDs 已成为毒品市场盛行的一类新精神活性物质[3-4]. 同时，BZDs 和DBZDs 会通过服用者排泄物经市政管网汇入污水处理厂，因生活污水中检出BZDs 和DBZDs 的报道逐年增多，有关部门已将依替唑仑等BZDs 和DBZDs 作为重点监管对象[5].此外，污水处理厂未能去除的BZDs 和DBZDs 原药或代谢产物随出水排入地表水环境，因其仍具有较高的生物活性，给水生生物[6-7]和居民饮用水[8-9]安全带来了潜在威胁. 针对BZDs 和DBZDs 使用造成的社会问题和环境问题，对此类药物的使用情况进行实时监测，并估算其使用量，对禁毒部门制定管控政策和新型污染物健康风险评价具有重要意义[10-11].

环境分析科学技术的发展催生了基于污水流行病学(wastewater-based epidemiology，WBE)的毒品滥用监测手段，该方法通过对生活污水中目标化合物浓度水平的分析，获取接近实时的区域毒品滥用水平、时空分布等关键信息[12-15]，较传统药物滥用调查方法更客观高效. 欧洲[16-17]、亚洲[18]、美洲[19]等地区已广泛应用WBE 方法监测其传统和新型毒品的滥用水平. 随着社会对公共健康关注度的不断提高，WBE 的研究对象逐渐转向了与人体健康相关的生物标志物，如烟草、酒精[20]、咖啡因[21]等合法成瘾性物质，具有强效镇痛效果的曲马多、阿片类药物[22]，治疗细菌疾病的抗生素[23]以及与糖尿病高血压等常见基础病有关的二甲双胍[24]、美托洛尔[25]等，以进一步挖掘污水中所包含的人类生活方式及健康状况信息. 此外，在新型冠状病毒全球大流行的背景下，以病原体为生物标志物，污水流行病学在传染病预警、疾病传播动态监测以及社区感染人数预测等方面的作用和价值同样被不断发掘[26-27]. 然而，针对治疗失眠、焦虑的BZDs 和新精神活性物质DBZDs 的WBE 研究仍然较为匮乏. Baker 等[28]利用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术建立了污水中65 种非法药物及处方药的分析方法，其中包含地西泮、硝西泮等7 种常用BZDs 处方药，并对英国城市污水中BZDs 进行了检测，发现该类药物浓度在11.9~209 ng/L 之间；Yuan等[29]报道了国内阿普唑仑、劳拉西泮及奥沙西泮在北京医疗废水和生活污水中的赋存情况，Wu 等[8]对黄浦江及沿江污水厂中地西泮、阿普唑仑、艾司唑仑等8 种BZDs 处方药进行监测，结果表明该类药物在北京、上海各类水体中广泛存在. 由于BZDs 药物种类繁多，现有报道中所包含的BZDs 种类较少，且多为地西泮、奥沙西泮等常用药物，缺乏针对尼美西泮、三唑仑等BZDs 类第三代毒品以及吡唑仑、依替唑仑等非法DBZDs 的相关研究. 因此，建立一种涵盖较全种类BZDs 和DBZDs 的高灵敏度、高选择性污水分析方法，可对BZDs 和DBZDs 的使用情况进行更为系统全面的监测.

该研究以25 种BZDs 和DBZDs 为研究对象，利用固相萃取(SPE)前处理技术和LC-MS/MS 实现对污水样品中目标化合物的分析测定，并对分析方法进行了优化. 通过回收率、基质效应、检出限和定量限、精密度等质量控制指标对分析方法进行评价. 通过对北京市主城区6 家污水厂进水样品的分析验证了优化后方法的可靠性，以期为BZDs 和DBZDs 的精确监管、来源追溯提供可靠的技术手段，也为进一步开展该类药物的污水流行病学研究提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

该试验所用标准样品具体包括：常用BZDs 处方药及其代谢产物阿普唑仑(ALP)、α-羟基阿普唑仑(OHALP)、氯硝西泮(CZP)、7-氨基氯硝西泮(7ACZP)、地西泮(DZP)、去甲地西泮(NDZP)、替马西泮(TZP)、奥沙西泮(OZP)、艾司唑仑(EZM)、劳拉西泮(LZP)、咪达唑仑(MZM)、硝西泮(NZP)、氯甲西泮(LMZP)；BZDs 类第三代毒品氟硝西泮(FNZP)、尼美西泮(NMZP)及其代谢产物7-氨基尼美西泮(7ANMZP)、三唑仑(TZM)；非法DBZDs 标准样品氯地西泮(CDZP)、地洛西泮(DLZP)、氟丙西泮(FBZP)、甲氯硝西泮(MCZP)、吡唑仑(PZM)、依替唑仑(ETM)；非苯二氮䓬类新型安眠药富马酸喹硫平(QTP)和唑吡坦(ZPM)(均为浓度100 μg/mL 的甲醇溶液，纯度>99%). 9 种氘代内标ALP-D5、 OHALP-D5、 DZP-D5、 NDZP-D5、 OZP-D5、EZM-D5、 LZP-D4、 ETM-D3和ZPM-D6(均 为 浓 度10 μg/mL 的甲醇溶液，纯度>99%)，以上标准样品均购自美国Sigma-Aldrich 公司；甲醇(LC-MS 级)和乙腈(LC-MS 级)均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；甲酸、甲酸铵、氨水均购自上海安谱试验科技股份有限公司，均为HPLC 级；超纯水由MilliQ 系统(德国Merck KGaA 公司)制备；Cleanert PEP 和Cleanert PCX(60 mg，3 mL)固相萃取柱购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；针式过滤器(1.0 μm，玻璃纤维)购自天津市科艺隆试验设备公司；离心过滤管(0.2 μm)购自美国Costar 公司.

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱联用仪(Triple QuadTM6500+)购于美国AB SCIEX 公司；固相萃取装置(SBEQCG1416)、氮吹仪(EFAA-DF24)购于上海安谱实验科技股份有限公司；涡旋振荡器(VXMNDG)购于奥豪斯仪器(常州)有限公司；离心机(MiniMax17)购于湖南可成仪器设备有限公司；KQ3200B 型超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司.

1.3 LC-MS/MS 条件优化

根据目标化合物的性质选择离子源和离子化模式. 将浓度为20 ng/mL 的目标化合物标准溶液通过针泵恒流的进样方式注入质谱，选取2 个丰度强且稳定的子离子分别作为定量离子和定性离子. 采用多反应监测(MRM)模式优化各特征离子的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)，最终根据各目标化合物的保留时间设置分段采集模式以实现最大的响应强度. 采用安捷伦InfinityLad Poroshell HPH C18 液相色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，通过优化流动相pH、添加剂、洗脱梯度等条件，实现对目标化合物的有效分离并缩短分析周期.

1.4 样品前处理方法

该研究采用固相萃取法(SPE)对样品进行浓缩和净化，固相萃取柱使用前依次向管内加入3 mL 甲醇、3 mL 超纯水和3 mL pH=2 的超纯水进行活化.取50 mL 经1 μm 滤膜过滤后的污水样品，添加100 μL浓度为50 ng/mL 的内标混合溶液，静置5~10 min 使其与样品混合均匀. 调节固相萃取装置使样品以1 mL/min 的速度均匀加载，污水加载完成后依次使用2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇淋洗. 待萃取柱填料干燥后使用4 mL 5%甲醇氨溶液洗脱，洗脱液收集在10 mL 玻璃试管内，使用缓和氮气在恒温条件下缓慢将洗脱液吹至干燥. 向试管中加入500 μL 50%甲醇水溶液复溶管底残留物，振荡至洗脱物完全溶解，此时各污水样品内标浓度均为10 ng/mL. 复溶液经0.2 μm 离心过滤管过滤后装入专用样品瓶，4 ℃下保存等待LC-MS/MS 分析测定.

1.5 质量控制

1.5.1 回收率

分别取25、125 和250 μL 浓度为20 ng/mL 混合标准溶液加入到50 mL pH=2 的超纯水中配成不同浓度梯度的溶液，每组设置3 个平行样品，并设置一组流程空白. 按1.4 节样品前处理方法处理加标样品并上机测定，根据流程空白、加标样品的测定数据以及实际加标浓度计算得到经固相萃取后不同浓度25种目标化合物的回收率.

1.5.2 基质效应

该试验选取北京肖家河污水处理厂的进水作为基质效应供试水样，按1.4 节对供试水样进行样品前处理，使用前处理后的供试水样配制体积为500 μL、浓度范围为1~10 ng/mL 的加标水样. 经LC-MS/MS分析测定得到各目标物质在污水样品和不同浓度的加标污水样品、标准样品中的响应峰面积，比较加标前后目标物质响应的变化，评价基质对分析仪器响应信号的抑制或增强效应，计算公式[30]：

式中：ME 表示基质效应，%；Aaddition表示经LC-MS/MS分析测定得到的各目标物质响应峰面积；Ablank为污水中目标物质的峰面积；Astandard为目标物质标准样品峰面积.

1.5.3 检出限和定量限

将系列低浓度混合标准溶液(0.01~0.1 ng/mL)上机测定，以信噪比S/N 为3 时对应的浓度为仪器检出限(ILOD，ng/L)，S/N 为10 时对应的浓度为仪器定量限(ILOQ，ng/L). 方法检出限(MLOD，ng/L)和定量限(MLOQ，ng/L)分别通过式(2)(3)计算：

式中：V1为上机浓缩液的体积，取值为500 μL；V2为前处理所取污水样品的体积，取值为50 mL.

1.5.4 标准曲线的线性及范围

该试验对环境样品中目标物质的浓度范围进行估计，在估计浓度上限的2~3 倍内配制含甲醇体积50%、浓度梯度范围为0.01~10 ng/mL 的系列标准溶液. 上机测定后拟合标准曲线，相关系数(R2)应不低于0.99，同时满足范围内的标准样品分析定量准确度在80%~120%之间.

1.5.5 精密度

采用对同一标准样品连续多次测定结果(n=4)和多天重复测定结果(n=4)的相对标准偏差(RSD)来评价仪器的日内精密度与日间精密度，15%的RSD作为方法可接受的标准上限.

1.6 使用量估算

利用污水处理厂日均流量、服务区域常住人口数据等可估算出地区目标物质的人均负荷水平，进而反向推算出药物使用量，其计算公式：

式中：L为药物千人均负荷量，mg/(1 000 inh·d)，其中inh 表示inhabitant；Cin为污水处理厂进水样品浓度，ng/L；Fin为污水处理厂的平均进水流量，m3/d；P为污水处理厂服务人口数；U为北京市各BZDs 的使用量，mg/(1 000 inh·d)；E表示目标物质生物标志物的人体排泄率，%；MWratio表示目标物质母体与其生物标志物的摩尔质量比值.

2 结果与讨论

2.1 优化后的LC-MS/MS 条件

25 种目标化合物分子结构中均含氮原子，且多呈仲胺或叔胺形式，在ESI 离子化模式下易与氢离子结合形成带正电荷的母离子[M+H]+，因此该研究选择在正离子检测模式下，采用MRM 模式对所有目标化合物进行检测. 离子源电压(IS)为4 500 V，离子源温度(TEM)为450 ℃，气帘气(CUR)压力为25 psi，干燥气(GS1)压力为65 psi，辅助气(GS2)压力为55 psi，碰撞池气压(CAD)为6 psi. 各目标化合物及其相应内标质谱参数见表1.

表1 质谱检测条件Table 1 Experimental conditions for mass spectrometry analysis

BZDs 在酸性条件下易于质子化，因此该研究选用10 mmol/L 甲酸铵(含0.1%甲酸)水溶液(流动相A)/乙腈(流动相B)作为流动相体系，以提高目标化合物的离子化率. 由于多数BZDs 结构和性质相似，其在色谱柱上的保留时间较为接近，故采用梯度洗脱方式提高其分离效果. 同时，7ACZP、7ANMZP 和ZPM的极性较强，因此设置较低比例的有机相作为初始流动相条件，以获得较为理想的保留时间. 优化后的洗脱梯度：0~0.5 min，10% B 相；0.5~5 min，10%~90% B 相；保持90% B 相0.4 min；5.4~5.8 min，10%~90% B 相；保持10% B 相2.2 min. 色谱柱温度为40 ℃，流速0.4 mL/min，进样体积为2 μL. 图1 为优化后25 种目标化合物的色谱图，该方法能够在5.4 min 内实现对所有物质的有效分离，显著缩短了分析周期，同时提高了仪器对目标化合物的灵敏度.

图1 目标化合物高效液相色谱图Fig.1 Ultra-performance liquid chromatography chromatograms of all target compounds

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 固相萃取柱的选择

该研究选择SPE 技术对样品进行净化与富集，并比较Cleanert PCX 和Cleanert PEP 固相萃取柱(分别简称“PEP 柱”和“PCX 柱”)对25 种目标化合物的净化回收效果，2 种柱子均按照1.4 节方法对污水样品进行前处理，具体回收率如图2 所示. 两种萃取柱均采用聚苯乙烯/二乙烯苯为填料，PEP 柱表面同时具有亲水性和憎水性基团，对各类极性、非极性物质具有较为均衡的吸附作用；PCX 柱则兼有阳离子交换和反相吸附混合作用力. 试验结果表明，PEP 柱无法实现对OHALP 的吸附，对FNZP、MCZP、MZM、7ANMZP 等物质的回收率低于60%，对OZP、PZM、LMZP、NMZP 等物质的回收率则超过了200%；PCX柱对25 种目标物质均有较好的吸附和净化效果，因此该研究选用PCX 柱进行SPE 前处理.

图2 不同SPE 柱待测目标化合物回收率比较Fig.2 Comparison of recoveries using different SPE columns

2.2.2 淋洗条件的优化

PCX 柱在前处理过程中会吸附污水基质中的部分干扰组分，因此需要加入淋洗步骤降低基质组分对准确定量的影响. BZDs 多为中等或弱极性化合物，易溶于甲醇、乙腈等试剂，不易溶于水. 该研究在污水样品加载完成后设置4 mL 纯水、4 mL 2%甲酸甲醇溶液和2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇3 种淋洗条件并比较其净化效果. 如图3 所示，使用4 mL 纯水淋洗时多数目标化合物的损失较少，但对非极性干扰组分净化效果不佳；使用4 mL 2%甲酸甲醇溶液淋洗时对基质中干扰组分去除效果较好，但导致FNZP、MCZP、NZP 等物质损失较多，回收率低于80%；使用2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇淋洗时，25 种目标化合物回收率均在80%~120%之间，净化效果较为理想. 导致这一结果的原因为甲酸水能够促进目标化合物质子化，使得萃取小柱对药物的保留作用更稳定，而甲醇能有效去除干扰性基质，因此该研究选用2 mL 2%甲酸水溶液-2 mL 甲醇作为前处理的淋洗溶液.

图3 不同淋洗条件下待测目标化合物的回收率比较Fig.3 Comparison of recoveries using different flushing conditions

2.2.3 洗脱和复溶条件的优化

BZDs 经样品加载后以质子化形式吸附于萃取柱，因其多为弱碱性化合物，在碱性条件下更易被洗脱溶液提取. 该研究选择在甲醇中加入适量氨水来增加洗脱溶液的pH，以提高目标化合物的洗脱效率. 结果表明，连续分批加入体积为1 mL 的洗脱溶液时，初始流出液中多数物质洗脱率高于40%，随着洗脱液体积的增加，在第4、第5 批次洗脱流出液中多数目标化合物洗脱率低于1%，因此该研究选择4 mL 5%甲醇氨溶液作为洗脱液. 对于复溶过程，该研究分别考察了30%、50%、80% 3 种不同体积分数甲醇水溶液的复溶效果. 结果显示，在30%甲醇水溶液复溶条件下CDZP、MZM、QTP 等物质未能实现较好的回收效果，而甲醇体积分数为80%时将削弱2.3.2 节淋洗步骤对萃取柱的净化功效，使用50%甲醇水溶液复溶则能够保证目标药物的充分复溶和净化效果，因此该研究选用50%甲醇水溶液作为复溶溶液(见图4).

图4 不同复溶条件下待测目标化合物的回收率比较Fig.4 Comparison of recoveries using different re-solvents

2.3 已优化方法的评价

2.3.1 回收率和基质效应

如表2 所示，经PCX 柱固相萃取后，25 种目标化合物在不同浓度梯度下的回收率均在80%~120%之间，基质效应(ME)在——20%~20%之间，满足检测要求.

表2 优化方法后目标化合物的回收率和基质效应Table 2 Recoveries and matrix effects of all target compounds using optimization method

2.3.2 检出限、定量限、标准曲线线性、仪器准确度及精密度

如表3 所示，25 种目标化合物的方法检出限和方法定量限在0.02~3.7 ng/L 之间，标准曲线在10~10 000 ng/L范围内线性表现良好(R2>0.99)，不同浓度标准样品定量准确度在80%~120%之间. 此外，仪器日内和日间精密度RSD(n=4)在1%~13%之间，均小于15%，仪器稳定性可达到试验要求. 因此，该研究所采用的分析方法能够满足多种BZDs 和DBZDs 的同步定量分析.

表3 优化方法后目标化合物的检出限、定量限、线性范围及精确度Table 3 MLOD, MLOQ, linearity and precision of all target compounds using optimization method

2.4 分析方法在实际污水样品中的应用

该研究于2020 年12 月——2021 年1 月对北京市6 家市政污水处理厂(WWTP-1~WWTP-6)的进水进行采样(24 h 混合水样)，生活污水比例均高于90%，具体运行数据见表4. 采用上述优化方法对样品进行前处理和分析测定.

表4 北京市6 家污水处理厂的基本情况Table 4 Basic information on the six WWTPs in Beijing

检测结果显示，进水样品中18 种目标化合物被检出. ALP、DZP、NDZP、OZP、EZM、NMZP、MZM、QTP、ZPM 检出率为100%，TZP 检出率高于90%，表明BZDs 在北京地区被广泛使用. 其中OZP 在6 个污水厂进水中平均检出浓度最高，范围为(15.1±1.4)~(22.4±3.8) ng/L，其 次 为QTP〔(10.1±1.4)~(18.5±1.5)ng/L〕 、 NMZP〔 (7.5±1.9)~(16.8±1.8) ng/L〕 、 DZP〔(2.9±0.2)~(7.1±2.0) ng/L〕、EZM〔(2.6±0.8)~(4.9±0.7)ng/L〕和LZP〔(3.1±3.9)~(8.8±7.4) ng/L〕，其余目标化合物浓度均小于4 ng/L(见表5). 值得注意的是，18 种检出物质中有4 种属于DBZDs(见表5)，分别为CDZP、ETM、FBZP 和MCZP，其浓度范围为(0.03±0.1) ng/L(ETM) ~ (0.3±0.7) ng/L (MCZP). 在我国，DBZDs 未得到药物监管部门的生产使用许可，无法通过合法途径获取. 此外，由于以上4 种DBZDs 结构或取代基团的特殊性，无法通过合法BZDs 代谢或降解生成. 因此，采样污水处理厂服务区内可能存在DBZDs 滥用现象，应加强对此类药物的检测与管控.

表5 目标BZDs 和DBZDs 在北京污水处理厂进水中的平均浓度Table 5 Concentrations of target BZDs and DBZDs in influences of Beijing wastewater treatment plants

以药物母体或代谢产物作为生物标志物，利用1.6 节式(3)(4)估算北京地区检出率较高的几种常用BZDs 的使用量. 结果显示，QTP〔(401.8±198.7) mg/(1 000 inh·d)〕、NMZP〔(301.1±177.0) mg/(1 000 inh·d)〕、MZM〔(68.0±32.6) mg/(1 000 inh·d)〕 、 ZPM〔 (36.0±14.9)mg/(1 000 inh·d)〕及EZM〔(24.7±9.1) mg/(1 000 inh·d)〕的使用量远高于OZP〔(7.4±2.5) mg/(1 000 inh·d)〕、ALP〔(4.0±4.9) mg/(1 000 inh·d)〕和DZP〔(3.5±1.5)mg/(1 000 inh·d)〕. 该研究结果低于2014 年Wang 等[31]对北京地区DZP 使用量的估算值〔(7.6~10.6) mg/(1 000 inh·d)〕，这可能与药物生物标志物的选择、居民用药习惯的改变等因素有关.

3 结论

a) 该研究对污水样品前处理方法和仪器条件进行了优化，结果表明前处理过程应选用Cleanert PCX萃取柱，依次使用2 mL 2%甲酸水溶液、2 mL 甲醇淋洗填料，使用4 mL 5%甲醇氨溶液洗脱目标化合物，氮吹后用500 μL 50%甲醇水溶液复溶残留物.

b) 该试验方法验证结果表明，25 种目标化合物在回收率、基质效应、检出限与定量限、线性范围等方面符合试验要求，该方法能够实现超痕量目标化合物的准确、高效检测.

c) 对北京市6 家污水处理厂进水样品的测定说明该方法能够满足实际样品的分析测定要求. BZDs在北京市生活污水中广泛存在，虽然DBZDs 检出率较低，但可能存在滥用现象，需加强对此类药物的监测.

d) 由于未考虑BZDs 在污水管网中的稳定性，因此该研究对北京地区BZDs 使用量估算存在一定不确定性. 未来可开展BZDs 稳定性相关研究，从方法学上提高其估算结果的准确性.