滇池藻毒素时空分布特征及其与环境因子的相关性分析

罗 婧，陶 冕，李 冲，李涛燕，王绍艳，蒋昌李，程云轩，段平洲

1. 中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

2. 昆明市城市排水监测站，云南 昆明 650500

蓝藻水华一直以来是困扰水环境治理的重要“顽疾”，其中主要表现在蓝藻水华会产生多种蓝藻毒素，其在水体中分布、迁移及转化进一步影响水环境安全[1-2]. 微囊藻毒素(Microcystins，MCs)为富营养化湖泊中最常见的一种天然毒素，由于检测方法复杂，检测时间较长，致使MCs 产生并释放到饮用水或娱乐用水中，同时对水产品(鱼类、贝类等)食用安全性的影响威胁到我国人民的健康[3-5]. 目前已经发现的MCs 异构体近百种，最常见的有MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF、MC-LW、MC-WR、MC-LA、MC-LY，其中L、R、Y、F、W 分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸. 世界卫生组织推荐的饮用水MCs 限量不超过1 μg/L，MC-LA、MC-LR、MC-YR、MC-RR 被美国环境保护局(US EPA)列为重点监测和控制对象[6].

已有大量的研究报道了我国湖泊和水库中MCs的赋存情况，中部地区太湖和鄱阳湖MCs 的最大平均浓度分别为1.00 和1.26 μg/L[7-8]，华北地区官厅水库和洋河水库分别为4.32 和0.98 μg/L[9]. 而以滇池为代表的云南高原地区湖泊MCs 污染较为严重，已经成为制约当地经济社会发展的重要环境问题之一[10-12].滇池是我国污染较为严重的湖泊，其富营养化导致水质下降、藻华频发以及主要生物类群发生剧变，造成水生生态系统受到严重破坏，促进了MCs 产生[13-17].葛思敏等[18-19]对滇池MCs 时空分布的初步研究和分析表明，滇池水体中MCs 浓度明显较高. 但这些研究局限于滇池的部分区域和时间段，关于滇池整体MCs 浓度的季节性变化和相关性研究还鲜见报道.因此研究滇池藻类污染，防范MCs 给水环境及人类健康带来的威胁已迫在眉睫[20-21]. 在滇池水生态严重退化条件下，开展滇池MCs 监测分析和影响因素研究，以期为滇池饮用水源地保护和探究MCs 产生规律提供科学依据.

虽然现有研究对MCs 含量和种类的影响因素有了较为广泛的研究，但大多数是基于实验室培养的模拟数据，复杂背景下的野外观测较少，而且监测的MCs 种类有限，很少针对多种MCs 含量从水体理化性质因素的整体角度进行分析[22-23]. 已有研究表明，鄱阳湖水环境中MCs 浓度与蓝藻生物量、温度、TN浓度和TP 浓度均呈显著正相关[24]，但在其他湖区MCs 的影响因子却明显不同，这可能是由于不同湖泊具有不同的气候和水文特征[25]. 因此，需要对滇池MCs 产生的环境因子进行深入探究. 另外，对于MCs生态风险的研究迫切需要一套可以同时检测多种MCs 的分析方法，短时间内对自然水体进行高效、精准、灵敏地定量分析，在蓝藻水华暴发的背景下及时提供水体的毒性预警，可为相关主管部门快速研判水体中痕量微囊藻毒素的污染状况、主要优势异构体的鉴别提供方法保障，同时为MCs 的暴露风险评估、保障人体健康路径和城市供水预处理工艺研究提供必要的理论基础.

1 材料与方法

1.1 研究区域

滇池流域位于云贵高原中部(102°29′E~103°01′E、24°29′N~25°28′N)，地处云南省昆明市南部. 滇池的平均水体深度为5.3 m，湖体面积达309.5 km2，分为草海和外海，它们相互连接却又几乎不可互换，其中滇池的主体为外海. 流域面积为2 920 km2，湖体库容为15.6×108m3，有2 个下泄水出口. 多年平均入湖水资源量为9.7×108m3，2013 年实施了牛栏江-滇池补水工程，年均补水量为5.6×108m3. 常年汇入滇池的河流有35 条，其中面积大于100 km2的有盘龙江、洛龙河、宝象河(新宝象河)等10 条河流；面积介于50~100 km2之间的有新运粮河、东白沙河(海河)、马料河、南冲河、淤泥河等5 条河流；面积介于10~50 km2之间的有老运粮河、采莲河、大清河、枧槽河、广普大沟、金汁河、中河(护城河)、古城河8 条河流；面积小于10 km2的有乌龙河、大观河、西坝河等12条河流.

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 试剂

主要试剂包括甲醇(色谱级，Fisher)、乙腈(色谱级，Fisher)、甲酸(质谱级，Waters)、MCs 标准品(MC-RR、MC-LR、MC-YR、MC-WR、MC-LA、MC-LF、MC-LY、MC-LW)(95%, Bepure)、超纯水(娃哈哈)、亲水性混合纤维素酯过滤膜(0.22 μm，杭州特种纸业有限公司)和20 mL 灭菌一次性注射器.

1.2.2 仪器

主要仪器包括超高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪(UPLC-MS/MS，美国沃特世公司)、ACQUITY UPLC BEH C18 分析柱(1.6 μm，2.1 mm×50 mm，美国沃特世公司)和Oasis HLB Direct Connect HP 在线固相萃取柱(21 mm×30 mm，20 μm，美国沃特世公司).

1.2.3 仪器条件

上样体积：5 mL，水样先经过0.22 μm 滤膜过滤后直接上样.

在线固相萃取方法(四元泵)：0.5%甲酸-水溶液(流动相B)，0.1%甲酸-乙腈/甲醇(体积比为90∶10)溶液(流动相C)，甲醇/丙酮/正己烷(体积比为1∶1∶1)溶液(流动相D). 萃取程序：0~0.5 min，100%流动相B；0.5~3.8 min，95%流动相B + 5%流动相C；3.8~4.1 min，100%流动相D；4.1~7.0 min，5%流动相B + 95%流动相C；7.0~11.0 min，100%流动相B.

梯度洗脱程序设置(二元泵)：0.1%甲酸-水溶液(流动相A)，0.1%甲酸-乙腈/甲醇(体积比为90∶10)溶液(流动相B). 洗脱程序：0~3.8 min，95%流动相A+5%流动相B；3.8~7.0 min，5%流动相A+95%流动相B；7.0~9.0 min，95%流动相A+5%流动相B；9.0~11.0 min，5%流动相A+95%流动相B.

质谱条件：正离子扫描；多反应监测(MRM)模式；电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压3.70 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂温度500 ℃；脱溶剂气流量1 000 L/h；锥孔气流量50 L/h；锥孔气压30 V；碰撞气流量0.06 mL/min. 8 种MCs 的质谱参数如表1 所示.

1.3 样品采集

a) 监测点布设. 本研究采用昆明市城市排水监测站布设的滇池湖体监测点，包括滇池全湖23 个自动或人工加密监测点位以及10 个国控监测点位，其中草海5 个、外海28 个. MCs 浓度监测采样布点情况如图1 所示.

图1 滇池湖体采样点分布Fig.1 Distribution of sampling points in Dianchi Lake

b) 样品采集与保存. 采样时间为2022 年2 月、5 月、8 月和11 月. 用2.5 L 玻璃采水器采集水下50 cm水样. 所有样品冷藏状态下及时送至实验室，取1 L水用于测定微囊藻生物质浓度，另500 mL 用于测定MCs 浓度.

1.4 质量控制与数据分析

在滇池湖水中加标10、100 和1 000 ng/L 浓度的MCs 标准溶液，每个浓度水样平行测定6 次，计算回收率及相对标准偏差，水中8 种MCs 的加标回收率大于90%，相对标准偏差小于10%，说明该方法可满足实际水样检测.

利用中国科学院资源环境科学数据中心(http://www.resdc.cn)2015 年中国土地利用遥感监测数据提取滇池水体边界，分辨率为30 m×30 m. 借助ENVI 5.1、ArcGIS 10.8 软件进行空间裁剪、掩模、重分类，将采集监测MC 浓度数据导入影像，建立MCs 浓度时间和空间序列栅格数据集，揭示滇池MCs 浓度的时空分布规律.

测定各采样点平行样，取平均值. 使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，包括方差分析(ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)测验环境因子与MCs 浓度的时空差异，采用并通过Pearson 相关性分析研究MCs 浓度与环境因子的关系(P>0.05 时相关性不显著，P<0.05 时相关性显著，P<0.01 时相关性极显著). 使用Origin 2018 软件绘制浓度柱状图，使用ArcGIS 10.8绘制空间分布图.

2 结果与分析

2.1 MCs 检测方法的准确度与回收率

本研究建立了在线固相萃取-超高效液相色谱质谱法联用测定地表水中8 种MCs 的检测方法. MCs检测方法优化后8 种MCs 的保留时间(min)、线性范围(ng/L)、相关系数(R2)、检出限(limit of detection,LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)、回收率(%)和相对标准偏差(%)如表2 所示. 8 种MCs 在5~1 000 ng/L 的范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，8 种MCs 的回收率均大于90%且相对标准偏差均小于5%，定量限(LOQ)为0.082~0.297 ng/L，均低于GB 3838——2002《地表水环境质量标准》对MC-LR 规定的标准值(1.0 μg/L). 与已有文献[26-27]相比，该方法测试时间短(11 min)，灵敏度高，准确性强，能够为实时、快速监测富营养化水体中MCs 污染状况提供科学的分析方法，为饮用水源地的健康风险预警提供参考.

表2 8 种MCs 检测方法的准确性指标Table 2 Accuracy index of 8 MCs detection methods

2.2 滇池MCs 时空分布规律

2.2.1 滇池MCs 的污染程度分析

本文以滇池2022 年全年的MCs 为研究对象，探索其时空分布规律. MC-RR、MC-LR、MC-WR 和MC-LW的检出率最高，均为100%；MC-LA、MC-LF 的检出率较高，分别为94.6%和93.9%；MC-LY 和MC-YR的检出率较低，分别为46.6%和48.6%. 2022 年2——11 月滇池水体中8 种MCs 的污染程度如图2 所示.由图2 可见，滇池MCs 浓度呈现明显的季节性变化规律，即冬季最低，2022 年2 月MCs 总浓度范围为16.271 6~122.847 0 ng/L；春季快速上升，MCs 总浓度范围为51.263 0~1 245.258 3 ng/L；夏季最高，8 月MCs总浓度范围为141.547 5~896.803 7 ng/L；秋季较高，MCs 总浓度范围为28.473 3~409.177 5 ng/L. MCs 的总浓度峰值出现在5 月，但8 月的MCs 浓度平均值(511.101 9 ng/L)要高于5 月(447.469 3 ng/L). 据国家地表水水质自动站监测的结果显示，滇池水体中营养盐在冬季和春季处于最低水平，夏季和秋季含量较高. 因此冬季水温较低以及营养盐因子的限制作用，影响了藻类生长，减少了MCs 的释放；春季随着温度的升高，藻类开始快速生长并向水体中释放MCs；夏季为滇池蓝藻水华暴发的高峰期，2020 年9 月卫星遥感监测到滇池发生一次大规模水华，因此具有较高的MCs 浓度平均值[18]；秋季随着温度降低，藻类快速死亡，MCs 浓度迅速降低，但由于温度小幅波动或回升，导致藻类缓慢生长，因此部分区域的MCs 浓度还维持在较高水平.

图2 滇池MCs 的污染情况Fig.2 MCs pollution amount in Dianchi Lake

综合近年来对滇池MCs 的研究可知，2003 年MCs 最高浓度为1.16 μg/L[28]，2009 年8 月——2010 年7 月MCs 总浓度在0.17~1.03 μg/L 范围内[29]，2014 年1 月和3 月MCs 的总浓度分别为9.28 和5.55 μg/L[30]，2020 年第3 季度MCs 总浓度平均值为2.412 μg/L[18].其他高原湖泊如洱海，MCs 主要种类为MC-LR 和MC-RR，MC-LR 最高值(3.657 μg/L)出现在8 月，最低值(0.056 μg/L)出现在2 月[29]，这与滇池MCs 的季节分布和种类组成非常相似. 近年来，滇池的蓝藻水华防治工作取得了重大进展[31]，MCs 的平均浓度显著下降，但在部分点位MCs 浓度仍会超过1.0 μg/L的警戒值，因此需要加强滇池水质监管和水华应急管理，保障居民的人体健康.

2.2.2 滇池MCs 的组成分析

如图3 所示，对滇池MCs 总含量贡献最高的是MC-LR、MC-LW、MC-RR 和MC-WR，但随着季节有所波动和变化. 在冬季，MC-LW 占比(37.35%)最高，其次为MC-LR(23.54%)和MC-RR(13.12%)；随着温度升高，MC-LR 的占比快速增高，在春季和夏季均超过50%，MC-LW 占比快速降低，而在秋季时再度上升；MC-RR 和MC-WR 的占比则较为稳定. 推测主要有三方面原因：①温度或水环境因子变化导致的藻类种群结构发生变化，从而改变了MCs 的组成成分[32-33]；②温度或水环境因子变化导致MCs 合成或释放的基因受到影响从而改变MCs 的组成成分[34-35]；③不同MCs 分子具有不同的热稳定性或水解特性[34]，从而影响了其在水环境中的赋存. MC-LR 在蓝藻水华暴发期贡献最高，因此可作为滇池MCs 的重点关注因子，同时MC-LR、MC-LW、MC-RR 和MC-WR 可作为环保部门的重点关注对象.

图3 滇池MCs 成分分析Fig.3 Composition analysis of MCs in Dianchi Lake

2.2.3 滇池MCs 时空分布规律

本文以滇池4 个季节MCs 为研究对象，探索其时间空间的分布规律. 如图4 所示，滇池的MCs 浓度分布具有明显的时空差异性和显著规律. 在秋冬季MCs 浓度总体处于较低水平，但在中部的观音山西-观音山中区域检测出了较高的MCs 浓度，呈现出南北低、中部高的分布特征. 而在春夏时节，MCs 的总体浓度都处在较高水平，重污染的区域分布较为相似，集中在滇池中部区域(包括观音山西、观音山中、观音山东和捞鱼河湿地)和北部区域. 不同的是，春季时草海的MCs 浓度较低而外海北部(福保湾、灰湾西、灰湾中)整体较高；而夏季时，外海和草海MCs浓度都较高，外海中部和南部的MCs 浓度明显升高[19].

图4 滇池MCs 浓度时空分布特征Fig.4 Temporal and spatial distribution characteristics of MCs in Dianchi Lake

除夏季外，草海水域的MCs 浓度均显著低于其他区域. 夏季乌龙河口(894.1 ng/L)和断桥(877.4 ng/L)的浓度最高，这可能是由于产毒微囊藻在8 月时大量死亡，使MCs 大量释放到水体中；而在外海北部和南部，春季的MCs 浓度高于夏季，则主要是由于水流较慢造成MCs 的累积；滇池中部区域四季MCs 的浓度均较高，这可能是由于滇池常年自西南向东北的风向，以及自草海向外海的水力流场综合作用的结果，造成了MCs 在中部的汇聚，同时观音山对MCs 的扩散起到了一定的阻碍作用.

2.3 MCs 与生物和环境理化因子的相关性分析

研究表明自然水体中产生的MCs 来源于蓝藻细胞，因此本文分析了浓度较高的6 种MCs 与生物因子(藻细胞密度、Chla)以及水体理化因子之间的相关性，以上数据来源于2022 年滇池10 个国控点位的监测结果. 根据2.2.2 节对MCs 分布规律和成分占比的分析，可以发现MC-LR 贡献最高，占比最稳定，因此作为重点关注对象，相关性分析时以MC-LR 作为代表性因子. 分析结果(见表3)显示，在生物因子方面，滇池MC-LR 与藻细胞密度具有显著的负相关关系(P<0.05)，这是由于MC-LR 在产毒微囊藻死亡后才会释放到水体中，此时藻细胞已大量死亡或沉积到湖底，而在本研究中采集的是上层水体样品，因此MC-LR 浓度的升高与生物量的最大值间具有一定的滞后性，这也解释了滇池春季藻细胞密度最高以及MC-LR 最高浓度出现在夏季的原因[36]；同时，MC-LR 浓度与Chla 浓度之间具有极显著的正相关关系(P<0.01)，Chla 反映了水体中藻类的丰度、生物量和变化规律，因Chla 也采集于上层水体，MC-LR和Chla 同源且同时受到风向和水力条件的影响，所以二者的相关性很高. 滇池MC-LR 浓度与藻细胞密度的相关性和太湖、鄱阳湖的研究结论存在较大差异[25,29]，这是由于滇池常年自西南向东北的风向，以及特殊的地面流场和水流特性造成的[37]，加之滇中引水工程显著加快了草海的水体交换速率，而太湖和鄱阳湖的大部分区域水体流动相对缓慢，造成了滇池在驱动因子上的差异.

表3 滇池MCs 浓度与生物和理化因子之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between concentration of MCs and biological/physicochemical factors in Dianchi Lake

冬季藻类具有从北向南递增的趋势，滇池南监测点的藻密度最大；滇池春季藻类呈现北部和南部高、中部低的趋势，其中点位滇池南的藻密度最大，点位白鱼口和草海中心的藻细胞密度最低；夏季藻密度呈现从北向南递减的趋势，其中点位滇池北的藻密度最大，点位白鱼口的藻密度最小；秋季藻密度呈现从北向南递增的趋势，其中点位灰湾的蓝藻密度最大，点位草海的蓝藻密度最小[16]. 可以看出，滇池MCs 浓度随着藻密度升高而呈现降低的趋势.

同时，MC-LR 的产生也受到水体的理化因子影响，因此本文分析了MC-LR 与营养盐(COD、NH4+-N、TP、TN、高锰酸盐指数、BOD5)和理化指标(pH、DO、透明度)的相关性，结果如表3 所示. MC-LR 浓度与COD 浓度无显著的相关性，与NH4+-N 浓度呈显著正相关(P<0.05)，与TP 浓度呈极显著正相关(P<0.01)，与TN 浓度呈显著负相关(P<0.05)，与pH 和DO 浓度均无显著的相关性，与高锰酸盐指数呈显著正相关(P<0.05)，与BOD5呈极显著正相关(P<0.01)，与透明度呈显著正相关(P<0.05). 上述结果表明，光照强度(透明度)和营养盐(氮、磷、有机物)是控制滇池MC-LR 产生的重要因子，这与前人对滇池的研究结果[38-39]类似. 其中，TP 对藻类生物量的增加起到显著作用，这与大部分研究的结果[40]一致. MC-LR 浓度与BOD5的相关性明显高于COD 浓度和高锰酸盐指数，说明可生物利用的营养物质是藻类繁殖的主控因子. MC-LR 浓度与NH4+-N 浓度之间具有显著的相关性，很可能是由于入滇河流承接了城镇污水和面源污染，MCs 浓度高的区域均有入滇河流的分布. 另外，MC-LR 浓度与TN 浓度呈显著负相关，这可能是由于TN 浓度升高会显著地抑制TP 从沉积物中释放[41-42]，而随着多项水质净化工程的建设，内源污染已成为滇池TP 的主要来源[43-44].

3 结论

a) 通过在线固相萃取-UPLC-MS/MS 建立了8种MCs 的快速检测方法，省去了繁杂的离线固相萃取程序，该方法测试时间短(11 min)、灵敏度高、重现性强，为监管部门提供了技术思路.

b) 滇池MCs 污染程度得到了较大幅度削减，整体上处于较低水平，但是在春夏季的局部区域污染严重，可能存在较高的生态风险.

c) 滇池MCs 具有明显的时间和空间变化规律，时间上呈现夏季最高、春季次之、秋季和冬季较低的趋势；空间上，在秋冬季呈现出南北低、中部高的分布特征，春夏季重污染的区域集中在滇池中部和北部. 建议开展更长周期的连续监测研究，掌握MCs 在滇池水体中的分布规律，为有效控制MCs 和净化水环境奠定基础.

d) 对滇池MCs 总量贡献最高的是MC-LR、MC-LW、MC-RR 和MC-WR，MC-LR 和MC-LW 的占比随季节有较大波动，其他MCs 的占比则相对稳定.

e) 滇池MCs 与藻细胞密度呈显著负相关，与Chla 浓度呈极显著正相关，可能是由于滇池特殊的地面流场和水流特性造成的. 相关性分析表明，光照强度(透明度)和营养盐(氮、磷、有机物)是控制滇池MCs 产生的重要因子. 建议进一步摸清滇池MCs在风力、流场作用下的迁移机制，为MCs 溯源和生态风险防控提供依据.